一种斑蝥酸钠治疗肺癌LAC细胞的方法技术

一种斑蝥酸钠治疗肺癌LAC细胞的方法，取细胞生长期的LAC细胞，分别加入2.5、12.5、25μg/mL的斑蝥酸钠，20μg/mL羟基喜树碱（HCPT），并以生理盐水作用阴性对照，每组均设3个复孔；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖抑制作用；采用流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡及p53、bcl2基因的蛋白表达。

A Sodium Cantharidate Therapy for LAC Cells of Lung Cancer

A method of treating LAC cells of lung cancer with sodium cantharidin was introduced. The LAC cells of growth stage were taken and added with 2.5, 12.5 and 25 ug/mL sodium cantharidin, 20 ug/mL hydroxycamptothecin (HCPT), respectively. Three compound pores were set in each group as negative control with normal saline. The inhibitory effect of sodium cantharidin on the proliferation of LAC cells of human lung cancer was detected by MTT method. Flow cytometry was used to detect the inhibitory effect of sodium cantharidin on the proliferation of LAC cells of lung cancer. The apoptosis of tumor cells and the expression of p53 and BCL2 genes were quantitatively detected by cytometry.

【技术实现步骤摘要】
一种斑蝥酸钠治疗肺癌LAC细胞的方法
本专利技术涉及一种斑蝥酸钠治疗肺癌LAC细胞的方法，具体地说是以一种斑蝥酸钠治疗肺癌LAC细胞的方法。
技术介绍
目前公知的信号传导在细胞生长、增殖等调控中起重要作用，信号通路中不同组分的改变都会导致细胞增殖失控，产生癌变。通过阻断肿瘤细胞信号传导系统引起肿瘤细胞周期阻滞来阻抑肿瘤细胞生长、促进凋亡或死亡，正成为肿瘤学实验研究的热点。斑蝥素是斑蝥体内提取出来的有效成分，斑蝥酸钠是斑蝥素的半合成衍生物，其抗肿瘤作用确切，毒性和刺激性较斑蝥素轻，对肝癌、食管癌、肺癌和胃癌等恶性肿瘤有良好疗效，并已长期应用于肿瘤的临床治疗。
技术实现思路
研究对象：1、材料与方法；药物斑蝥酸钠注射液为贵州神奇制药有限公司产品，批号015028；羟基喜树碱(HCPT)为湖北省黄石飞云制药公司产品,批号003021。人肺癌LAC细胞株；由广州军区总医院肿瘤分子生物学研究所细胞室惠赠，用含体积分数为10%小牛血清（FCS）的RPMI1640培养液进行传代培养。主要试剂；RPMI1640细胞培养液为美国GIBCO公司产品；胰蛋白酶（Trypsin）为Serva产品；FCS购于华美上海分公司；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国SIGMA公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国SIGMA）；鼠抗人单克隆抗体p53、鼠IgG（400mg/L）及bcl2、鼠IgG（205mg/L）均为DAKO公司产品；羊抗鼠FITCIgG、柠檬酸固定液由中科院上海细胞生物研究所流式细胞室提供。1.4主要仪器96孔培养板（英国CORNINC）；CO2培养箱（德国HEREUS）；倒置显微镜（日本OLYMPUS）；博赛（BIOCELLHT）系列酶标仪（美国ANTHOS公司）；微量振荡器（北京海淀电子医疗仪器厂）；流式细胞仪（FACS－420型，美国BECKMANCOULTER公司）。2、方法；1.2.1、肿瘤细胞悬液的制备；将冻存的人肺癌细胞LAC按常规方法复苏，接种于含体积分数为10%FCS的RPMI1640培养液的50mL培养瓶中，传代培养，至细胞呈指数生长期时，弃培养液，加入250g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化液37℃消化2～5min，离心弃上清液,重悬细胞于含体积分数10%FCS的RPMI1640培养液中,台盼兰染色活细胞计数,调整细胞数为1×106/mL，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100μL。2.2、药物及浓度阳性对照药HCPT（1mg/mL）和实验用药斑蝥酸钠0.05mg/mL，依据静滴给药后，药物的血浆峰值（ρ1）浓度计算公式，ρ1/（μg·ml-1）［ρ2/(mg·mL-1)为每日用药量］。实验时根据换算结果加入到细胞培养液中，进行各项实验检测。斑蝥酸钠注射液成人给药量为0.5mg/d，依上述公式计算，得出斑蝥酸钠注射液的血浆峰浓度为2.5μg/mL。据此，斑蝥酸钠注射液实验浓度设定为2.5、12.5、25μg/mL3个浓度（以下简称BM1、BM2、BM3）；阳性对照药物HCPT。成人给药量为4mg/d，设定实验浓度为20μg/mL，以生理盐水（NS）为阴性对照组。2.3、MTT法检测细胞增殖96孔板置于37℃、体积分数5%CO2的饱和湿度培养箱中培养24h，实验孔分别加入HCPT10μL和BM1、BM2、BM3各10μL，对照孔加入等量NS液，每组3孔。继续培养48h，离心弃上清，每孔加入MTT（5mg/mL，10μL），继续培养6h，再离心弃上清，加入DMSO100μL，置微量振荡器5min，即放入自动读数酶标仪，以570nm为检测波长，测各孔的吸光度（D）值，根据下列公式计算抑瘤率：p抑瘤/%=（D对照组－D实验组）/（D对照组×100%。将实验重复3次。2.4、流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡将冻存的人肺癌细胞LAC按常规方法复苏，接种于含体积分数为10%FCS的RPMI1640培养液的50mL培养瓶中，传代培养，至细胞呈指数生长期时，随机分组加药，加入斑蝥酸钠注射液2.5μg/mL(血浆峰浓度)、HCPT20μg/mL，并设NS为对照组,置37℃、体积分数5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，药物作用48h后，离心收集细胞，用体积分数70%乙醇固定，进行流式细胞仪分析。上机前离心去除固定液，采用溴化乙啶（EB）一步插入法，DNA定量荧光染色（染液含EB10μg/mL、RNA酶10μg/mL，1%TritonX100），每组设3份样品，每份样品细胞调至1×106/mL，0℃～4℃染色30min后，流式细胞仪上机检测。将实验重复3次。2.5、流式细胞仪检测LAC细胞p53、bcl2基因的蛋白表达细胞悬液的制备同1.5.4。上机前离心去除固定液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，分别加入1：100稀释的鼠抗人p53单抗和1：40稀释的bcl2单抗，37℃孵育30min，PBS洗2次，弃上清，加入1：20稀释的羊抗鼠FITCIgG100μL，37℃孵育30min，离心洗2次，加入1mLPBS，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。BiosConsort30软件处理数据，计算阳性蛋白标记率。将实验重复3次。统计学处理结果比较用方差分析，并行两两比较的q检验，全部数据处理均在微机上用SAS6.04软件完成。结果；斑蝥酸钠具有明显的抑制人肺癌LAC细胞增殖的作用，且呈剂量相关性，不同浓度之间有显著性差异（P＜0.01），3个不同浓度组与对照组比较差异均有显著性意义（P＜0.01），其抑瘤效应优于HCPT组。斑蝥酸钠和HCPT均能明显抑制LAC细胞增殖，S期细胞明显减少，细胞被阻止于G0/G1期，部分细胞发生凋亡（21.5%和12.2%）,出现亚二倍体峰（Ap），斑蝥酸钠诱导LAC细胞凋亡效应优于HCPT，两组比较有显著性差异（P＜0.01）。斑蝥酸钠作用后，肺癌LAC细胞的p53基因表达上调,而bcl2基因表达下调。专利技术目的：斑蝥素是斑蝥体内提取出来的有效成分，斑蝥酸钠是斑蝥素的半合成衍生物，其抗肿瘤作用确切，毒性和刺激性较斑蝥素轻，对肝癌、食管癌、肺癌和胃癌等恶性肿瘤有良好疗效，并已长期应用于肿瘤的临床治疗，但其作用机制尚未明了。我们选择了两个与细胞增殖、分化和凋亡密切相关的肿瘤基因p53基因和bcl2基因，检测其蛋白的表达，以探讨斑蝥酸钠引起肺癌LAC细胞周期的影响及其初步分子机理。技术方案：取细胞生长期的LAC细胞，分别加入2.5、12.5、25μg/mL的斑蝥酸钠，20μg/mL羟基喜树碱（HCPT），并以生理盐水作用阴性对照，每组均设3个复孔；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖抑制作用；采用流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡及p53、bcl2基因的蛋白表达。专利技术有益效果：斑蝥酸钠具有明显的抑制人肺癌LAC细胞增殖的作用，其抑瘤效应优于羟基喜树碱(HCPT)组。斑蝥酸钠作用于肺癌LAC细胞后引起S期细胞明显减少，细胞被阻止于G0/G1期，部分细胞发生凋亡，效应优于HCPT（P＜0.01）。斑蝥酸钠作用后，LAC细胞的p53基因表达上调，而bcl2基因表达下调。最佳实施方式：运用药物治疗。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑蝥酸钠治疗肺癌LAC细胞的方法，取细胞生长期的LAC细胞，分别加入2.5、12.5、25μg/mL的斑蝥酸钠，20μg/mL羟基喜树碱（HCPT），并以生理盐水作用阴性对照，每组均设3个复孔；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖抑制作用；采用流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡及p53、bcl2基因的蛋白表达。

【技术特征摘要】
1.一种斑蝥酸钠治疗肺癌LAC细胞的方法，取细胞生长期的LAC细胞，分别加入2.5、12.5、25μg/mL的斑蝥酸钠，20μg/mL羟基喜树碱（HCPT），并以生理盐水作用阴性对照，每组均设3个复孔；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖抑制作用；采用流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡及p53、bc...

【专利技术属性】
技术研发人员：马宝花，
申请(专利权)人：马宝花，
类型：发明
国别省市：甘肃,62