一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，属于医药生物技术领域，通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，设计引物长度，合成引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，将配制好的PCR反应体系进行扩增，将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，挑取单克隆进行测序，测序成功的DNA序列为SEQ ID NO.1，命名为Sst‑1，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，纯化方便，整个体系使用单酶催化，底物用量/NAD用量高达1540:1，辅酶循环次数高，且反应条件温和。

Preparation of Azanavir Intermediate as an Anti-AIDS Drug

The invention discloses a preparation method of Azanavir intermediate for anti-AIDS drug, which belongs to the field of medical biotechnology. The secondary structure of gene and codon preference are adjusted by the method of whole gene synthesis, the length of primers is designed, and the primers are synthesized. After the obtained primers are dissolved in double steaming water, the prepared PCR reaction is added to the following reaction system. The system was amplified, the DNA fragments obtained by PCR were gelatinized and purified, and the monoclones were selected for sequencing. The successful DNA sequence was SEQ ID NO.1, named Sst_1, and its corresponding amino acid sequence was SEQ ID NO.2. The invention has mild reaction conditions, low requirements for equipment, no need for high temperature or cooling in production process, low energy consumption, convenient purification, single enzyme catalysis, high substrate dosage/NAD dosage of 1540:1, high coenzyme cycle times, and mild reaction conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法
本专利技术涉及一种阿扎那韦中间体的制备方法，特别是涉及一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，属于医药生物

技术介绍
阿扎那韦，以商品名Reyataz出售，是一种用于治疗和预防艾滋病毒/艾滋病的抗逆转录病毒药物，是目前世界上主要的抗艾滋病药物之一，它在世界卫生组织的基本药物清单上，是基本卫生系统所需的最重要的药物，百时美施贵宝公司最早开发了阿扎那韦，在中国专利CN10282508C有公开介绍，美国FDA在2003年批准其上市，中国也于2007年批准其上市。(2R，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇做为制备阿扎那韦的关键中间体，目前主要生产工艺有化学合成法和生物合成法两种，其中生物法可由相应的酮还原酶或微生物全细胞生物转化3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇获得。在日本专利JP4746548B2中公开了JP4746548B2最早提出用生物法制备(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，该专利利用一种新型的羰基還元酵素，不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达；利用Primer Premier和OPTIMIZER进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到以下引物：

【技术特征摘要】
1.一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达；利用PrimerPremier和OPTIMIZER进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM，将配制好的PCR反应体系置于博日XPcycler基因扩增仪中进行扩增，将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点，挑取单克隆进行测序，测序成功的DNA序列为SEQIDNO.1，命名为Sst-1，其对应的氨基酸序列为SEQIDNO.2。2.如权利要求1所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，反应体系为：2mMdNTPmix(2mMeachdNTP)，5μl；10×Pfubuffer，5μl；PfuDNApolymerase(10U/μl)，0.5μl；ddH2O使得反应体系总体积至50μlddH2O；反应体系中按下列程序进行扩增：98℃，30s；55℃，45s；72℃，120s；35x。3.如权利要求2所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：参考蛋白Cod-CK基因序列的合成根据AJM46704.1所示序列，对该蛋白的编码序列进行全基因合成，并克隆至pET30a中，得到对照蛋白表达质粒Cod-CK；步骤2：摇瓶表达测试挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中，添加卡那霉素，过夜培养，次日取1L三角瓶，接入培养基中，添加卡那霉素；加IPTG培养，培养结束后，将培养液离心收集湿菌体，将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测；步骤3：分批补料发酵分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，初级接种菌种制备培养物，OD2.0时接入，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联控制在30％自动控制，发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料；步骤4：生物转化反应在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Sst-1，摇床反应；步骤5：生物转化反应在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Sst-2，30C摇床反应；步骤6：生物转化反应在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Sst-3，30C摇床反应；步骤7：生物转化反应在三口烧杯中放入磁子搅拌子，并依次加入甲苯，异丙醇，3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，混匀预融解底物，再加入MgCl2，最后加入NAD，粗酶液Cod-CK，30C摇床反应；步骤8：TLC检测产物将上述反应中的3小时反应转化产物进行TLC检测；步骤9：酶活检测取6个离心管，分别标号1-6，分别加NADH溶液，然后每管补加磷酸盐缓冲液，检测并记录吸光度的值，得到NADH的标准曲线Y＝k*X，用纯水按一定的倍数稀释酶液，取离心管，按以下比例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿。4.如权利要求3所述的一种抗艾滋病药物阿扎那韦中间体的制备方法，其特征在于，步骤2中，挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中；培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L；添加卡那霉素至50mg/L，30℃，250rpm过夜培养；次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L；于30℃中培...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，钱明，
申请(专利权)人：南京诺云生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32