一种软骨诱导性基质材料的制备方法与应用技术

本发明专利技术属于组织诱导性生物材料制备技术领域，具体涉及一种软骨诱导性基质材料的制备方法与应用。本发明专利技术提供的软骨诱导性基质材料的制备方法是将小牛皮进行脱毛、分割、脱脂和脱重金属处理后；接着进行灭菌、酸浸泡、酶消化处理，得胶原液；最后将胶原液进行盐析、纯化、透析、中和，即得。采用本发明专利技术提供的软骨诱导性基质材料的制备方法制备得到的基质材料具有生物活性高，生物相容性好，生物可降解性和低抗原性的优点，使用该基质材料作为干细胞载体，诱导其成软骨分化可以实现软骨缺损的修复再生，也可以作为组织工程支架材料和软组织填充材料等。

Preparation and application of a cartilage-inducing matrix material

The invention belongs to the technical field of tissue-induced biomaterials preparation, in particular to the preparation method and application of a cartilage-induced matrix material. The preparation method of the cartilage-inducing matrix material provided by the invention is that calf skin is dehairing, segmenting, degreasing and deheavy metal treatment, followed by sterilization, acid immersion, enzymatic digestion to obtain collagen solution, and finally collagen solution is salted out, purified, dialyzed and neutralized. The matrix material prepared by the preparation method of the cartilage-inducing matrix material provided by the invention has the advantages of high bioactivity, good biocompatibility, biodegradability and low antigenicity. Using the matrix material as a stem cell carrier, the cartilage-inducing differentiation can realize the repair and regeneration of cartilage defects, and can also be used as tissue engineering scaffold material and soft tissue filling. Filling materials, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种软骨诱导性基质材料的制备方法与应用
本专利技术属于组织诱导性生物材料制备
，具体涉及一种软骨诱导性基质材料的制备方法与应用。
技术介绍
组织诱导性材料是由中国科学家提出并得到国际社会认可的生物材料专有名词，由此开创的研究方向和研究内容已成为二十一世纪国际生物医学材料领域的热点和重点。以骨诱导人工骨为代表的组织诱导性材料已经获得广泛的研究并取得重要成果，已经有大量的临床实践证明其良好疗效。软骨缺损的修复是一个长期困扰临床的难题，软骨诱导性材料为软骨缺损修复提供了新的思路和途径。基于仿生学的原理和方法，以胶原、透明质酸为代表的天然高分子材料是软骨诱导性材料的主要研究对象。其中，胶原作为一种天然的结构蛋白质受到广泛的关注，已有大量的研究将胶原制备成海绵、薄膜、水凝胶等形式应用于组织工程支架材料。如：专利文献CN104645403A公开了一种胶原蛋白海绵的制备方法，该制备方法包括将胶原蛋白粉配制成浓度为5～8mg/mL的胶原蛋白溶液，接着放置在-80℃下真空冷冻干燥48h，然后加入pH为3～6的由体积分数分别为1～5％缩水甘油醚和10～40％乙醇配制成的交联溶液中，于4℃下浸泡48h，清洗后在压缩状态下在-80℃真空冷冻干燥，包装后用60Co辐照灭菌，得到胶原蛋白海绵产品。专利文献CN104338175A公开了一种鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法，该制备方法包括前处理、酸溶、盐析、透析纯化、超滤膜浓缩，浓缩后的胶液用0.22μm～0.45μm板式膜进行除菌，然后加入0.1～5％(w/v)药用活性炭搅拌后过滤，以去除热源；胶液置于-60℃低温冷冻干燥机冻干，得到胶原蛋白海绵。然而由于胶原是由氨基酸序列组成的大分子蛋白质，具有独特的四级结构，容易在受热、辐照等情况下引起分子链断裂、结构解旋等变化，从而丧失其良好的生物相容性、低免疫原性等特点，并最终导致其植入体内后失去组织诱导性。因此，采用常规的湿热、干热、辐照等灭菌方式会对胶原的性能产生明显的影响而不适用于胶原基组织诱导性基质材料，特别是含有大量水分的胶原水凝胶材料的灭菌。同时，由于胶原是呈纤维状的长链大分子，且溶解后的胶原溶液粘度大，使其难以通过过滤方式达到胶原溶液的有效灭菌。而且，现有的软骨缺损修复以传统难以实现再生的微骨折法或者基于自体软骨细胞体外培养的自体软骨细胞移植术为主，尚未有软骨诱导性基质材料结合干细胞在不添加外源性生长因子的情况下实现软骨缺损再生修复的报道，其原因是多样的，其中缺乏理想的软骨诱导性基质材料是主要因素之一。作为最受广泛关注和研究的天然高分子材料之一，目前的胶原产品通常都要经过适度的化学改性或与其他材料复合，并以冻干等方式获得胶原海绵等含水量很低的产品后，再采用辐照方式灭菌。辐照灭菌除了会导致部分胶原分子链断裂、结构丧失以外，还有可能产生新的交联而改变其微观结构，最终导致胶原产品理化性能的改变和生物学特性的损失，失去组织诱导能力。而且，通过冷冻干燥制备胶原海绵后再进行辐照灭菌，会使制备得到的胶原海绵难以重新溶解或成胶，不能用于制备具有软骨诱导能力的胶原基生物医用材料。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种通过过程控制和化学灭菌的方法来制备软骨诱导性基质材料，制备得到的软骨诱导性基质材料具有生物活性高，生物相容性好，生物可降解性和低抗原性的优点，使用该基质材料作为干细胞载体，诱导其成软骨分化可以实现软骨缺损的修复再生，也可以作为组织工程支架材料和软组织填充材料等。本专利技术提供了一种软骨诱导性基质材料的制备方法，包括以下步骤：S1将小牛皮进行脱毛、分割、脱脂和脱重金属预处理；S2将步骤S1预处理后的小牛皮进行灭菌、酸浸泡、酶消化处理，得胶原上清液；S3将步骤S2得到的胶原上清液进行盐析、纯化，得胶原粗品；S4将步骤S3得到的胶原粗品进行透析，得胶原纯品；S5将步骤S4得到的胶原纯品与中和剂混合，得软骨诱导性基质材料。进一步地，所述步骤S1的小牛皮为来源于新宰杀的经检验检疫且可溯源的小牛。进一步地，所述步骤S1的预处理的具体步骤为：A脱毛：采用机械方法刮除毛及表皮等杂物后充分清洗；B分割：将脱毛后的小牛皮采用切割粉碎机切割成1mm3的小块；C脱脂：将切割后的小牛皮加入到体积比为1:1的氯仿和乙醇的脱脂液中脱脂，所述脱脂液与切割后的小牛皮的重量比为(5～10):1，在4℃摇床上震荡8～12h后更换脱脂液；重复脱脂2～4次后，将脱脂后的小牛皮加入到无水乙醇中清洗，所述无水乙醇与脱脂后的小牛皮的重量比为(5～20):1，在4℃摇床上震荡8～12h后更换无水乙醇，重复清洗2～4次后，用纯化水清洗3～5次，每次10～30min，得脱脂后小牛皮；D脱重金属：将步骤C得到的脱脂后的小牛皮加入到0.01～0.05mol/L的pH为10.5～11.0的EDTA-Na2溶液中，所述EDTA-Na2溶液的与脱脂后小牛皮的重量比为(5～10):1，在4℃摇床上震荡12～24h后，用10wt％的NaCl清洗2～4次，每次2～6h；接着用纯化水清洗3～5次，每次10～60min，即得。进一步地，所述步骤S2的具体步骤为：a灭菌：将步骤S1预处理后的小牛皮加入到含有0.5～2mol/L氯化钠的0.1～0.5％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液与预处理后的小牛皮的重量比为(10～50):1，在4℃摇床上震荡5～24h后，用无菌注射水充分清洗至中性；b酸浸泡：在无菌洁净环境下，将步骤a灭菌后的小牛皮加入到0.3～1.0mol/L无菌醋酸溶液中，调节pH为2.2～3.0，所述无菌醋酸溶液与灭菌后小牛皮的重量比为(20～60):1；c酶消化：将无菌胃蛋白酶溶于0.5mol/L醋酸，得到的胃蛋白酶溶液加入到步骤b的酸浸泡液中，所述胃蛋白酶的添加量为步骤b酸浸泡的小牛皮总重量的0.2～1.0％，在4℃摇床上连续震荡4～10天后，离心，收集上清液，得胶原上清液。进一步地，所述步骤S3的具体步骤为：I将步骤S2得到的胶原上清液用氢氧化钠溶液调节pH为6.5～7.5，加入4mol/L的无菌氯化钠溶液，使氯化钠浓度达到1～2mol/L，搅拌均匀，静置，离心，收集沉淀；II将步骤I得到的沉淀加入0.5mol/L的醋酸溶液中完全溶解，离心，收集上清液，重复步骤I2～3次，得胶原粗品。进一步地，所述步骤S4中的透析步骤为：将步骤S3得到的胶原粗品加入到含有0.5～2mol/L氯化钠的0.1～0.5％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液的添加量是胶原粗品重量的10～50倍，在4℃摇床上震荡5～24h后，用无菌注射水充分清洗至中性；移至无菌透析袋中使用0.1～0.5mol/L的无菌醋酸或0.001-0.01mol/L的无菌盐酸溶液充分透析，得浓度为0.5-3.5wt％的胶原纯品。进一步地，所述步骤S5中与中和剂的混合，包括以下步骤：步骤一：将步骤S4制备得到的胶原纯品离心脱泡后采用真空预灌封方法在无菌条件下灌装0.5～0.9ml于1ml或3mL鲁尔注射器，得胶原注射器；步骤二：将含1mmol/L～4.5mol/L氢氧化钠的10～200mmol/L磷酸盐缓冲液的中和剂，采用真空预灌封方法在无菌条件下灌装0.1～0.5ml于1ml鲁尔注射器，得中和剂注射器；步骤三：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种软骨诱导性基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1将小牛皮进行脱毛、分割、脱脂和脱重金属预处理；S2将步骤S1预处理后的小牛皮进行灭菌、酸浸泡、酶消化处理，得胶原上清液；S3将步骤S2得到的胶原上清液进行盐析、纯化，得胶原粗品；S4将步骤S3得到的胶原粗品进行透析，得胶原纯品；S5将步骤S4得到的胶原纯品与中和剂混合，得软骨诱导性基质材料。

【技术特征摘要】
1.一种软骨诱导性基质材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1将小牛皮进行脱毛、分割、脱脂和脱重金属预处理；S2将步骤S1预处理后的小牛皮进行灭菌、酸浸泡、酶消化处理，得胶原上清液；S3将步骤S2得到的胶原上清液进行盐析、纯化，得胶原粗品；S4将步骤S3得到的胶原粗品进行透析，得胶原纯品；S5将步骤S4得到的胶原纯品与中和剂混合，得软骨诱导性基质材料。2.如权利要求1所述的软骨诱导性基质材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的小牛皮为来源于新宰杀的经检验检疫且可溯源的小牛。3.如权利要求1所述的软骨诱导性基质材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的预处理的具体步骤为：A脱毛：采用机械方法刮除毛及表皮等杂物后充分清洗；B分割：将脱毛后的小牛皮采用切割粉碎机切割成1mm3的小块；C脱脂：将切割后的小牛皮加入到体积比为1:1的氯仿和乙醇的脱脂液中脱脂，所述脱脂液与切割后的小牛皮的重量比为(5～10):1，在4℃摇床上震荡8～12h后更换脱脂液；重复脱脂2～4次后，将脱脂后的小牛皮加入到无水乙醇中清洗，所述无水乙醇与脱脂后的小牛皮的重量比为(5～20):1，在4℃摇床上震荡8～12h后更换无水乙醇，重复清洗2～4次后，用纯化水清洗3～5次，每次10～30min，得脱脂后小牛皮；D脱重金属：将步骤C得到的脱脂后的小牛皮加入到0.01～0.05mol/L的pH为10.5～11.0的EDTA-Na2溶液中，所述EDTA-Na2溶液的与脱脂后小牛皮的重量比为(5～10):1，在4℃摇床上震荡12～24h后，用10wt％的NaCl清洗2～4次，每次2～6h；接着用纯化水清洗3～5次，每次10～60min，即得。4.如权利要求1所述的软骨诱导性基质材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的具体步骤为：a灭菌：将步骤S1预处理后的小牛皮加入到含有0.5～2mol/L氯化钠的0.1～0.5％过氧乙酸溶液的混合液中，所述混合液与预处理后的小牛皮的重量比为(10～50):1，在4℃摇床上震荡5～24h后，用无菌注射水充分清洗至中性；b酸浸泡：在无菌洁净环境下，将步骤a灭菌后的小牛皮加入到0.3～1.0mol/L无菌醋酸溶液中，调节pH为2.2～3.0，所述无菌醋酸溶液与灭菌后...

【专利技术属性】
技术研发人员：林海，郭立坤，樊渝江，张兴栋，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51