一种制备昆布二糖的方法技术

本发明专利技术公布了一种构建体外多酶分子机器，通过多酶级联催化来制备昆布二糖的方法，属于昆布二糖的酶催化制备领域。本发明专利技术所公开的昆布二糖的制备方法包括将淀粉中的葡萄糖单元通过葡聚糖磷酸化酶转化生成葡萄糖‑1‑磷酸，葡萄糖‑1‑磷酸与葡萄糖通过昆布二糖磷酸化酶合成昆布二糖。过程中通过添加促使淀粉完全磷解的其他辅助酶，例如异淀粉酶和葡聚糖转移酶等，可以进一步提高淀粉的利用率以及昆布二糖的最终浓度。该技术方法具有底物廉价易得，生产成本低，产品得率高，分离纯化简单等优势，可实现昆布二糖的规模化生产。

A Method for Preparing Kunbu Disaccharide

The invention discloses a method for constructing a multi-enzyme molecular machine in vitro to prepare kumbucha disaccharide through multi-enzyme cascade catalysis, which belongs to the field of enzymatic preparation of kumbucha disaccharide. The preparation method of Kunbu disaccharide disclosed in the present invention includes the conversion of the glucose unit in starch to glucose 1 phosphoric acid by glucan phosphorylase, and the synthesis of Kunbu disaccharide by the activity of Kunbu disaccharide phosphorylase. The utilization of starch and the final concentration of Kunbu disaccharide can be further improved by adding other auxiliary enzymes, such as isoamylase and glucan transferase, which promote the complete phosphorylation of starch. The technology has the advantages of cheap substrates, low production cost, high yield, simple separation and purification, and can realize the large-scale production of kumbu disaccharide.

【技术实现步骤摘要】
一种制备昆布二糖的方法
本专利技术属于生物制造领域，具体涉及一种以淀粉和葡萄糖为原料，通过体外酶法制备昆布二糖的方法。
技术介绍
昆布二糖是一种由β-1,3糖苷键连接的低聚糖，主要用于农业领域，并可用于天然防腐剂使用。目前，昆布二糖的生产主要还是传统的稀酸水解松针或者昆布等多糖。该工艺过程产率低、分离提取成本高，导致昆布二糖的价格居高不下。昆布二糖还能利用化学合成进行制备，利用卤素糖基作为糖基供体，通过来源于Koenigs-Knorr方法的O糖基化获得昆布二糖。然而最终产品不容易纯化，最终得率低于10％。随着工业酶生物技术的发展，有科学家开始尝试酶法合成昆布二糖。日本科学家就利用3个酶(蔗糖磷酸化酶，葡萄糖异构酶和昆布二糖磷酸化酶)，以蔗糖为底物生产昆布二糖，然而昆布二糖的得率只有50％左右，导致后续产品分离的成本较高。因此，亟待开发一种低成本，低污染，高得率的昆布二糖酶制备方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种制备昆布二糖的方法，其以淀粉和葡萄糖为底物，通过体外多酶反应体系催化生产昆布二糖，该方法具有产率高，生产成本低，环境友好等优点。为解决上述技术问题，本专利技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用酶催化反应制备昆布二糖的方法，其特征在于，反应体系中含有淀粉、葡萄糖、淀粉磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶。优选地，反应体系中淀粉的浓度为1‑200g/L，进一步优选为5‑50g/L，更优选为8‑20g/L，最优选为10g/L。优选地，反应体系中葡萄糖的浓度为1‑1000mM，进一步优选为10‑400mM，更优选为50‑200mM，最优选为100mM。优选地，反应体系中淀粉磷酸化酶的用量为0.1‑50U/mL，进一步优选为0.5‑10U/mL，更优选为1‑5U/mL，最优选为2U/mL。优选地，反应体系中昆布二糖磷酸化酶的用量为0.1‑50U/mL，进一步优选为0.5‑10U/mL，更优...

【技术特征摘要】
1.一种利用酶催化反应制备昆布二糖的方法，其特征在于，反应体系中含有淀粉、葡萄糖、淀粉磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶。优选地，反应体系中淀粉的浓度为1-200g/L，进一步优选为5-50g/L，更优选为8-20g/L，最优选为10g/L。优选地，反应体系中葡萄糖的浓度为1-1000mM，进一步优选为10-400mM，更优选为50-200mM，最优选为100mM。优选地，反应体系中淀粉磷酸化酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL，最优选为2U/mL。优选地，反应体系中昆布二糖磷酸化酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL，最优选为2U/mL。优选地，酶催化反应的温度为10-95℃，进一步优选为20-80℃，更优选为30-60℃，最优选为50℃。优选地，酶催化反应的时间为0.5-150小时，进一步优选为1-60小时，更优选为6-48小时，最优选为24-36小时。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，淀粉为可溶性淀粉、可溶性直链淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖和麦芽糖中的任意一种或多种的任意比例的混合物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，反应体系中还含有缓冲液、磷酸盐、镁盐。优选地，缓冲液为HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液例如柠檬酸钠缓冲液等，最优选为HEPES缓冲液。优选地，缓冲液的pH为5.0-8.0，更优选为6.0-7.5，最优选为7.0。优选地，反应体系中缓冲液的浓度为10-500mM，进一步优选为20-150mM，更优选为50-120mM，最优选为100mM。优选地，磷酸盐为磷酸钾、磷酸钠等，最优选为磷酸钾。优选地，反应体系中磷酸盐的浓度为1-50mM，进一步优选为2-30mM，更优选为5-25mM，最优选为20mM。优选地，镁盐为氯化镁、硫酸镁等，最优选为氯化镁。优选地，反应体系中镁盐的浓度为1-20mM，进一步优选为2-15mM，更优选为3-10mM，最优选为5mM。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，反应体系中加入葡聚糖转移酶。优选地，反应体系中葡聚糖转移酶的用量为0.1-10U/mL，进一步优选为0.2-5U/mL，更优选为0.5-2U/mL，最优选为1U/mL。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在反应体系中先加入淀粉磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶，反应一段时间后再加入葡聚糖转移酶。优选地，在反应体系中先加入淀粉磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶，在10-95℃反应0.25-75小时，进一步优选在20-80℃反应0.5-36小时，更优选在30-60℃反应6-30小时，最优选在50℃反应12-24小时。优选地，在反应体系中后加入葡聚糖转移酶后，继续在10-95℃反应0.25-75小时，进一步优选在20-80℃反应0.5-36小时，更优选在30-60℃反应6-30小时，最优选在50℃反应12-24小时。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，当淀粉中含有α-1,6糖苷键时，在反应体系中加入异淀粉酶。优选地，反应体系中异淀粉酶的用量为0.1-10U/mL，进一步优选为0.2-5U/mL，更优选为0.5-2U/mL，最优选为1U/mL。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在反应体系中先加入异淀粉酶，反应一段时间后再加入淀粉磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶；或者，在反应体系中先加入异淀粉酶，反应一段时间后再加入淀粉磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶和葡聚糖转移酶；或者在反应体系中先加入异淀粉酶，反应一段时间后加入淀粉磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶，再反应一段时间后再加入葡聚糖转移酶。优选地，在反应体系中先加入异淀粉酶，在10-99℃反应0.5-72小时，进一步优选在...

【专利技术属性】
技术研发人员：游淳，孙尚尚，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12