一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，所述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:2，所述羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，与野生型羊口疮病毒F1L蛋白相比，缺失了1‑70位的氨基酸序列，其能够有利于融合蛋白的表达，提高表达量，同时，在融合蛋白的C端加上6组氨酸标签，方便在后续生产中进行纯化，上述氨基酸序列中，相比传统的分离毒株的B2L氨基酸序列，将第9位氨基酸的V/L突变为G，即“IPVG或者IPLG突变为IPGG”，第35位的LDCF突变为LYCF，上述突变显著提高了融合蛋白的表达量和免疫原性。

A recombinant subunit vaccine of sheep aphthous ulcer virus and its production method

The present invention relates to a fusion protein rB2LcF1L of sheep aphthous disease virus. The amino acid sequence of the fusion protein of sheep aphthous disease virus B2L and F1L is SEQ ID No:2. The fusion protein rB2LcF1L of sheep aphthous disease virus is missing 1 to 70 amino acid sequences compared with the wild type of sheep aphthous disease virus F1L protein, which can facilitate the expression of the fusion protein and increase the expression level. At the same time, the fusion egg is fused. In the above amino acid sequence, compared with the B2L amino acid sequence of the traditional isolate strain, the V/L of the 9th amino acid was mutated to G, i.e. IPVG or IPLG was mutated to IPGG, and the LDCF of the 35th was mutated to LYCF. The above mutation significantly increased the expression and immunogenicity of the fusion protein.

【技术实现步骤摘要】
一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法
：本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法。
技术介绍
：羊口疮又称羊传染性脓疱，是一种严重威胁养羊业的接触性、嗜上皮性传染病，主要危害3～6月龄羔羊和部分成年羊。该病的临床症状表现为嘴唇、口黏膜部分皮肤红疹、脓疱、溃疡和结痂，羔羊表现为齿唇部破溃，不能进食，发病率高达100%，若继发或混合感染其他病原微生物死亡率较高，可达15%。羊口疮世界范围内发生，且广泛流行。近年来，随着我国养羊产业的发展和饲养方式的改变，该病的发生风险增大，波及的面积以及危害的严重程度也越来越高，给养羊业带来了巨大的经济损失。与此同时，作为一种人畜共患病，该病毒也危害人类的健康。该病在我国部分地区呈暴发和流行，其中甘肃、宁夏、四川、江苏、云南、青海、陕西、山东、内蒙古、新疆、贵州、黑龙江等省区均有此病发生和流行的报道。羊口疮从临床症状上容易诊断，目前尚无针对性药物用于治疗，通常使用抗生素防止继发或混合感染治疗无特异性药物，疫苗接种被认为是预防和控制该病可靠且有效的手段。当前国外主要用弱毒疫苗来预防羊口疮，由于各种原因目前在我国市场上无口疮弱毒疫苗供应，可能弱毒疫苗本身存在毒力返强、病毒扩散等缺陷。因此，研制使用简单、方便、免疫效果确实的羊口疮基因工程亚单位疫苗已成为防控羊口疮疫病的必然趋势。羊口疮病毒（Orfvirus，ORFV）属于痘病毒科（Poxviridae）脊索动物痘病毒亚科（Chordopoxrinae）的副痘病毒属（Parapoxvirus），其基因组约有135个基因，能够编码多种不同的蛋白。其中，Orf011（B2L）基因编码的42kU囊膜蛋白，是一种重要的免疫原性蛋白。此外，由于该基因能够检测出最低拷贝数的病毒粒子而被广泛应用于副痘病毒属病毒的实验室检测。经羊口疮病毒刺激后机体会产生细胞免疫反应和体液免疫反应，其中以细胞免疫应答为主，但体液免疫产生的抗体在抵御病毒方面也发挥一定的作用。研究表明，B2L蛋白是病毒表面囊膜的组成成分之一，能够刺激机体产生强烈的体液免疫应答，同时还可引起淋巴细胞的增殖分化。鉴于B2L蛋白的这种特性，其已经在不同的系统中获得表达，如原核系统、真核表达载体pCDNA3.1、pVAX1等。专利技术人本人也进行了相关的研究，“ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达”（西北农林科技大学学报（自然科学版），201745(9)）成功分离出1株羊口疮病毒，命名为ORFV-Yulin株，扩增的B2L全长基因长度为1137bp，与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近，核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99％和99.2％，通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了B2L基因，获得了重组蛋白。但经过血清学实验表明，其对免疫小鼠的保护力仅达到60%，不能满足疫苗生产的要求。另外，刘嫒等人（“羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达”，《中国人兽共患病学报》，201531(12)）以pVAX1为真核表达载体，构建真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L，转染至MDBK细胞，RT-PCR和IFA同时验证目的基因在MDBK细胞浆中能瞬时表达，该项技术中采用单独构建表达载体的方式，一方面操作比较复杂，另一方面，其仅能在真核细胞中实现瞬时表达，正如该文献中指出“由于pVAXl载体在pCDNA3.1载体基础上去掉多余的序列，故在细胞中只能瞬时表达不能筛选稳定表达的细胞系”，其不能获得稳定表达的细胞系，因此，仅考虑其用于双基因核酸疫苗，而不能用于工业化生产的亚单位疫苗，且其免疫效果尚待实验验证。专利技术专利申请CN201710138033.6由真核表达质粒pVAX1-FIL，pVAX1-B2L和pVAX1-IL-2组成的免疫原性组合物，所述羊口疮疫苗含有可以表达两个高度保守的羊口疮病毒基因的真核表达质粒和可以表达细胞因子IL-2基因的真核表达质粒作为疫苗抗原，通过构建真核表达质粒作为DNA疫苗来预防羊口疮，该疫苗能够有效刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答，对新型羊口疮疫苗的研究具有重要的临床意义。但是和刘媛等人的文献报道一样，该专利技术专利申请的方法仅能在真核细胞中实现瞬时表达，并不能获得稳定表达的亚单位疫苗，且涉及多个质粒的转化，其在传代过程中也容易发生质粒的丢失，其不能获得具有遗传稳定的表达细胞系。基于以上技术研究表明，目前的羊口疮病毒在常规细胞系上难以培养增殖，不适合制作灭活疫苗或者弱毒疫苗，而现有亚单位疫苗或核酸疫苗的研究也存在一定的缺陷，例如，遗传稳定性差，不能获得遗传稳定的表达细胞系，免疫原性差或者保护率低等。因此，亟需开发一种能够稳定表达、生产的羊口疮病毒亚单位疫苗。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术目的在于制备出羊口疮病毒重组亚单位疫苗，用于预防由羊口疮病毒引起的疾病。本专利技术专利制备的羊口疮病毒重组亚单位疫苗，是以从陕西榆林发病的陕北白绒山羊病料中分离出羊口疮病毒ORFV-Yulin株系的B2L和F1L为模板，采用经过密码子优化、并采用杆状病毒表达系统对B2L和F1L进行了串联表达。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行羊口疮病毒的理想候选疫苗。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术手段：一种羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，其特征在于，所述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo:2。编码羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的基因，所述编码羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的基因的核酸序列为SEQIDNo:1。上述氨基酸序列中，相比传统的分离毒株的B2L氨基酸序列，将第9位氨基酸的V/L突变为G，即“IPVG或者IPLG突变为IPGG”，第35位的LDCF突变为LYCF，上述突变显著提高了融合蛋白的表达量和免疫原性。所述羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，与野生型羊口疮病毒F1L蛋白相比，缺失了1-70位的氨基酸序列，其能够有利于融合蛋白的表达，提高表达量。同时，在融合蛋白的C端加上6组氨酸标签，方便在后续生产中进行纯化。一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株，所述毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15494；所述毒株能够稳定、高效地表达羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白。上述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo:2。所述重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株的制备方法包括如下步骤：步骤一，用化学合成的方法，合成序列为SEQIDNo:1的基因序列，共包含1908个核苷酸；步骤二，融合表达载体的构建：以人工合成的SEQIDNo:1的基因序列为模板，采用引物对1F/1R（序列3/序列4）进行PCR扩增；其中上游引物1F序列为：5’-CGCGCTAGCATGTGGCCGTTCTCCTCC-3’（SEQIDNo:3），其5’端引入限制性内切酶NheIⅠ位点及保护性碱基；下游引物1R序列为：5’-CCGAAGCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，其特征在于，所述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:2，所述羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，与野生型羊口疮病毒F1L蛋白相比，缺失了1‑70位的氨基酸序列，其能够有利于融合蛋白的表达，提高表达量，同时，在融合蛋白的C端加上6组氨酸标签，方便在后续生产中进行纯化，上述氨基酸序列中，相比传统的分离毒株的B2L氨基酸序列，将第9位氨基酸的V/L突变为G，即“IPVG或者IPLG突变为IPGG”，第35位的LDCF突变为LYCF，上述突变显著提高了融合蛋白的表达量和免疫原性。

【技术特征摘要】
1.一种羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，其特征在于，所述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo:2，所述羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L，与野生型羊口疮病毒F1L蛋白相比，缺失了1-70位的氨基酸序列，其能够有利于融合蛋白的表达，提高表达量，同时，在融合蛋白的C端加上6组氨酸标签，方便在后续生产中进行纯化，上述氨基酸序列中，相比传统的分离毒株的B2L氨基酸序列，将第9位氨基酸的V/L突变为G，即“IPVG或者IPLG突变为IPGG”，第35位的LDCF突变为LYCF，上述突变显著提高了融合蛋白的表达量和免疫原性。2.编码权利要求1所述的羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的基因，所述编码羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L的基因的核酸序列为SEQIDNo:1。3.一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株，所述毒株已于2018年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15494；所述毒株能够稳定、高效地表达羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白，所述羊口疮病毒B2L和F1L融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo:2。4.根据权利要求3所述的所述重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Bac-ORFV-01毒株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，用化学合成的方法，合成序列为SEQIDNo:1的基因序列，共包含1908个核苷酸；步骤二，融合表达载体的构建：以人工合成的SEQIDNo:1的基因序列为模板，采用引物对1F/1R（序列3/序列4）进行PCR扩增；其中上游引物1F序列为：5’-CGCGCTAGCATGTGGCCGTTCTCCTCC-3’（SEQIDNo:3），其5’端引入限制性内切酶NheIⅠ位点及保护性碱基；下游引物1R序列为：5’-CCGAAGCTTTTAGTGGTGATGGTG-3’（SEQIDNo:4），其5’端引入限制性内切酶HindIII位点及保护性碱基；扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NheⅠ/HindIII双酶切消化，与经过相同酶切消化的昆虫杆状病毒表达系统质粒pBac5载体连接，得到插入羊口疮病毒全长基因的阳性克隆pBac5-GB2LcF1L；将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用；步骤三：重组表达羊口疮病毒融合蛋白rB2LcF1L基因工程毒株的构建：取6孔细胞培养板，以1×106ml-1的细胞密度接种生长状态良好sf9细胞，置于27℃培养2h，待细胞的融合度达到80%左右时进行转染，用100µL无血清培养基把3µgpBac5-GB2LcF1L与3µg线性化的Bacmid混匀，作溶液I；用100µL无血清培养基稀释5µL的阳离子（梭华转染试剂）后，缓慢滴加到溶液I中，混匀，静置20min；将混合液加入到上述sf9的细胞板中，27℃孵育5～7d，荧光显微镜下观察报告基因cGFP的表达情况，待病变细胞达到90%以上...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯平，陈瑞，张磊，
申请(专利权)人：榆林学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61