一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用，包括：(1)样品来源；(2)菌株筛选；(3)木聚糖酶发酵液的制备等步骤，本发明专利技术首先在生长培养基进行菌株的分离培养，再利用双层平板法进行菌株的筛选，上层培养基中添加Azo‑xylan(Birchwood)作为筛选底物，该方法可以解决先培养微生物，再加入刚果红溶液进行颜色反应过程中菌落之间发生混杂的问题，还可以解决在制备平板时加入刚果红，再进行微生物培养过程中出现的假阳性问题。

Screening method and application of an efficient endoxylanase-producing strain

The invention provides a screening method and application of high-efficiency endoxylanase producing bacteria, including: (1) sample source; (2) strain screening; (3) preparation of xylanase fermentation broth and other steps. The method first isolates and cultures strains in growth medium, then screens strains by double-layer plate method, and adds Azo xylan (Birchwood) as screening substrate in upper medium. This method can solve the problem of mixed colonies in the process of culturing microorganisms first and then adding Congo Red solution for color reaction. It can also solve the problem of false positive in the process of preparing plate by adding Congo Red and then culturing microorganisms.

【技术实现步骤摘要】
一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用。
技术介绍
半纤维素是存在于自然界中非常丰富的资源，约占植物干重的35％，广泛存在于农副产品如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆及甘蔗渣中，在自然界中含量仅次于纤维素。木聚糖是半纤维素的重要组成部分，是由β-D-吡喃型木糖单元经β-1,4-糖苷键连接构成主链，主链上带有乙酰基、阿拉伯糖残基和葡萄糖残基等多种不同的取代基，来源或分支程度不同的主侧链与不同的取代基共同构成的复杂而多样的木聚糖分子。木聚糖的完全降解需要多种酶的共同参与，包括β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶、(EC3.3.1.37)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)等，其中，β-1,4-内切木聚糖酶是作用于木聚糖主链生成不同链长的寡糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶，同时也是目前研究较多，应用较广泛的木聚糖降解酶。利用酶法生产的低聚木糖在动物肠道内对双歧杆菌等有高选择性增殖效果，在降低当胆固醇、维持肠道健康和促进钙吸收等方面都有重要的作用。另外，木聚糖酶在制浆造纸、食品、饲料添加剂及生物转化等方面都起到重要的作用。目前木聚糖降解菌株的筛选多用刚果红染色法，主要通过两种方式，一种方式是先培养微生物，再加入刚果红溶液进行颜色反应，然后通过氯化钠脱色形成大小不一的木聚糖降解透明圈，这种方式的优点是显示出的颜色反应基本上是木聚糖降解菌的作用，缺点是该方式操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；另一种方式是在制备平板时加入刚果红，该方式的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质,能使产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应，另外某些具有降解色素能力的微生物在长时间的培养过程中会降解刚果红而形成透明圈，不易与木聚糖降解菌区分。本专利技术首先在生长培养基进行菌株的分离培养，再利用双层平板法进行菌株的筛选，上层培养基中添加Azo-xylan(Birchwood)作为筛选底物，可以解决上述问题，能快速、准确、有效的筛选内切木聚糖酶生产菌株。另外，利用该方法筛选到的菌株SaccharothrixvariisporeaYJ与以往报道筛选的菌株不同，其所产木聚糖酶可以直接水解玉米芯粉生产低聚木糖，省去了碱处理玉米芯制备木聚糖的步骤，从而降低了环境污染以及生产成本。
技术实现思路
对于以上现有技术中出现的问题，本专利技术以Azo-xylan(Birchwood)为筛选底物，利用双层平板法，可以解决上述问题。Azo-xylan(Bichwood)是由来源于桦木的木聚糖与染料RemazolbrilliantblueR结合生成的高分子化合物(1个RemazolbrilliantblueR结合20个糖残基)；木聚糖酶可以降解Azo-xylan生成低分子量的染料化合物和低聚糖，低分子量的染料化合物在乙醇溶液中是可溶性的(在上层平板的培养基中呈现透明状态)，而高分子量的染料化合物在乙醇溶液中则呈现为沉淀状态(在上层平板的培养基中呈现蓝色状态)。本专利技术在上层平板中添加Azo-xylan作为筛选底物，生产木聚糖酶的菌株在上层平板中产生透明圈，该方法能快速、准确、有效的筛选内切木聚糖酶生产菌株。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用，包括以下步骤：(1)样品来源：堆置发酵时间为3d，发酵温度为40℃的猪粪与甘蔗叶混合堆肥20g，初始C/N比为25:1，含水率为60％，初始pH为8.0得到发酵物；(2)菌株筛选：取1g步骤(1)中的发酵物加入10mL的无菌水中，然后梯度稀释成10-6-10-8，取100μL涂布于生长培养基上，35℃培养3-4d后倒上层筛选培养基，35℃继续培养1d，加入2ml95％的乙醇，用接种针挑选有水解圈的菌落划线培养，得到纯化菌株；将其命名为SaccharothrixvariisporeaYJ已于2018年9月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCCNO:60442，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。(3)木聚糖酶发酵液的制备：步骤(2)筛选到的纯培养菌株，接种至20ml生长培养基中，于35℃，160rpm培养过夜，作为制备木聚糖酶发酵液的种子液；取1ml种子液接种至100ml无菌发酵培养液中，于40℃，160rpm，震荡培养6d后，12000rpm，离心5min，取上清即为发酵产木聚糖酶的发酵液；(4)将得到的木聚糖酶发酵液对天然底物磨碎至150目的玉米芯进行降解，经过5-7h的处理后，可以从玉米芯获得还原糖。所述生长培养基制备方法为：NaNO32.0g，K2HPO41.0g，KCl0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，蔗糖10g，15g琼脂粉，ddH2O定容至1000ml，115℃灭菌25min。所述上层筛选培养基制备方法为：琼脂粉1g，Azo-xylan20ml，磷酸盐缓冲液(20mM，pH8.0)定容至100ml；所述发酵培养液制备方法为：NaNO32.0g，K2HPO41.0g，KCl0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，玉米芯4.0g通过60目过筛，定容至1000ml，115℃灭菌25min。SaccharothrixvariisporeaYJ菌株鉴定：利用细菌提取试剂盒提取基因组，16SrDNA基因PCR扩增：50μl体系，25μlPrimerSTARMaxDNA聚合酶(2×)，1μl模板，引物F(5'-AAATTTTTTTTCCCCCCCGG-3')和R(3'GGGCCCCCTTTAAAAAAAAAC-5')各1μl，22μlddH2O；反应程序：98℃4min，98℃10sec、55℃10sec、72℃1min30个循环，72℃延伸10min，PCR产物送华大基因测序。经DNA提取，PCR扩增，序列测序及比对，发现该菌株的16SrDNA序列与Saccharothrixvariisporea的同源性最高，为99.33％。将该菌株初步鉴定为Saccharothrixvariisporea，将其命名为SaccharothrixvariisporeaYJ(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：60442)。序列如下：GGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCACGGGGTCGAGTTGCAGACCCCGATCCGAACTGAGACCGGCTTTGTGGGATTCGCTCCACCTCACGGCTTAGCAGCCCTCTGTACCGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCCATGAGTCCCCGCCATAACGCGCTGGCAACATGGAACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用，其特征在于：包括以下步骤：(1)样品来源：堆置发酵时间为3d，发酵温度为40℃的猪粪与甘蔗叶混合堆肥20g，初始C/N比为25:1，含水率为60％，初始pH为8.0得到发酵物；(2)菌株筛选：取1g步骤(1)中的发酵物加入10mL的无菌水中，然后梯度稀释成10

【技术特征摘要】
1.一种高效内切木聚糖酶生产菌的筛选方法及其应用，其特征在于：包括以下步骤：(1)样品来源：堆置发酵时间为3d，发酵温度为40℃的猪粪与甘蔗叶混合堆肥20g，初始C/N比为25:1，含水率为60％，初始pH为8.0得到发酵物；(2)菌株筛选：取1g步骤(1)中的发酵物加入10mL的无菌水中，然后梯度稀释成10-6-10-8，取100μL涂布于生长培养基上，35℃培养3-4d后倒上层筛选培养基，35℃继续培养1d，加入2ml95％的乙醇，用接种针挑选有水解圈的菌落划线培养，重复步骤(2)直至得到纯化菌株；将其命名为SaccharothrixvariisporeaYJ现保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCCNO:60442；(3)木聚糖酶发酵液的制备：步骤(2)筛选到的纯培养菌株，接种至20ml生长培养基中，于35℃，160rpm培养过夜，作为制备木聚糖酶发酵液的种子液；取1ml种子液接种至100ml无菌发酵培养液中，于40℃，160rpm，震荡培养6d后，12000rpm，离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚健，沈爱喜，周希平，
申请(专利权)人：江西省农业科学院农业应用微生物研究所江西省农村能源研究中心，
类型：发明
国别省市：江西,36