褐飞虱NlAtg3基因、编码蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种褐飞虱NlAtg3基因、编码蛋白及其应用。NlAtg3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因是褐飞虱正常生存所必需，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。NlAtg3基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述的NlAtg3基因或蛋白的应用，用于农药研发和生物防治褐飞虱。本发明专利技术对该基因成功实施了RNA干扰，结果表明害虫的存活率下降，有望在实现抑制害虫的同时，充分发挥生态防治的功能。

NlAtg3 gene, coding protein and its application in Brown Planthopper

The invention discloses a NlAtg3 gene, coding protein and application of brown planthopper. The nucleotide sequence of NlAtg3 gene, as shown by SEQ ID NO:1, is essential for the normal survival of brown planthopper. Inhibition of NlAtg3 gene function will lead to a decline in the survival rate of brown planthopper. The NlAtg3 gene encodes a protein with amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:2. The application of the NlAtg3 gene or protein is used for research and development of pesticides and biological control of brown planthopper. The invention successfully implements RNA interference to the gene, and the results show that the survival rate of the pest decreases. It is hopeful that the function of ecological prevention and control can be brought into full play while controlling the pest.

【技术实现步骤摘要】
褐飞虱NlAtg3基因、编码蛋白及其应用
本专利技术涉及一种褐飞虱NlAtg3基因、编码蛋白及其应用。
技术介绍
褐飞虱（NilaparvatalugensStål）是一种单食性水稻害虫，主要通过取食水稻韧皮部汁液为害水稻。目前，对褐飞虱的应急防治主要以化学防治为主，但化学防治容易导致害虫的抗药性上升、水稻上有害物质残留、害虫再猖獗及环境污染等问题。在防治褐飞虱的农药中，曾经发挥过较好效果的有效农药，如氟虫腈、吡虫啉、噻嗪酮等，均已淘汰出局或限制使用，究其原因，此类化学农药多以大规模高强度杀灭害虫为目标，但是，由于褐飞虱种群遗传多样性非常复杂等现实原因，其中往往有部分个体能够存活下来，高选择压力的作用结果，最终会导致适应性更强的种群形成。另一方面，化学农药在杀死害虫的同时，也会危及包括天敌在内的非靶标生物，不可避免的会给农田生态系统造成负面影响，导致生态防治功能得不到应有的发挥。因此，筛选与发现新的褐飞虱防治靶标，调整目前的褐飞虱防治策略具有重要的现实意义。CN107988244A公开了一种褐飞虱生存相关的ATPSb基因、编码蛋白及其应用，该基因在维持褐飞虱正常的生存中发挥重要功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种褐飞虱NlAtg3基因、编码蛋白及其应用。本专利技术根据NlAtg3基因编码的蛋白质相对保守但核酸序列与其他生物同源性较低的特点，对靶标基因进行RNA干扰，实现了在核酸水平对褐飞虱的抑制，显著地降低了褐飞虱的存活率，并避免了在蛋白质水平采用的喷施农药等可能给非靶标生物造成的杀伤。本专利技术的技术方案如下：一种褐飞虱NlAtg3基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该基因编码ATG3蛋白，是褐飞虱正常生存所必需，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。一种所述的褐飞虱NlAtg3基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。一种所述的褐飞虱NlAtg3基因的应用，用于农药研发和生物防治褐飞虱。一种针对所述的褐飞虱NlAtg3基因的RNA干扰技术在控制褐飞虱方面的应用，所述的RNA干扰技术导致褐飞虱的存活率下降。一种如所述的褐飞虱NlAtg3基因编码的蛋白的应用，用于农药研发和生物防治褐飞虱。本专利技术的有益效果：（1）褐飞虱存活率下降，可以减轻害虫取食对水稻作物的直接危害。（2）本专利技术利用靶标基因的核苷酸序列与天敌核苷酸序列同源性较低的特点，可以在核酸水平上进行RNA干扰，避免了由于蛋白质结构保守对天敌等非靶标生物的伤害，有望在实现抑制害虫的同时，充分发挥生态防治的功能。附图说明图1是褐飞虱NlAtg3基因的mRNA表达水平。其中，1-2N:1-2龄若虫；3-4N:3-4龄若虫；5N:5龄若虫；E1-9:羽化1-9天的雌性褐飞虱。图2是RNA干扰对褐飞虱NlAtg3基因表达量的影响；图中数据为3次重复的平均值±标准偏差，星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在极显著差异（T检验，P<0.01）。dsGFP：对照组；dsNlAtg3：dsNlAtg3饲喂的RNA干扰组。图3是NlAtg3基因的RNA干扰对褐飞虱存活率的影响；图中数据为3次重复的平均值±标准偏差，星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在显著差异（T检验，P<0.05），双星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在显著差异（T检验，P<0.01）。具体实施方式ATPSb基因是线粒体中ATP合酶的一个亚基，ATP合酶负责线粒体中ATP的合成过程，这个基因功能被干扰会影响线粒体中ATP的合成（CN107988244A）。NlAtg3基因是褐飞虱中编码ATG3蛋白的基因，ATG3蛋白是细胞自噬(Autophagy)发生过程中的一种类泛素化E2蛋白，它催化ATG8蛋白磷脂酰乙醇胺化(Phosphatidylethanolamine,PE)。细胞自噬是普遍存在于生物体的一种细胞自我吞噬行为，是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡(自噬小体)包裹后，送入溶酶体中进行降解并得以循环利用。细胞自噬小体的形成有许多细胞自噬蛋白(Autophagy-relatedgene,ATG)参与并最终与溶酶体融合完成目标蛋白的降解。昆虫发育过程中细胞自噬发挥了重要作用，NlAtg3基因受到干扰，会影响昆虫细胞的自噬过程，进而影响昆虫的正常生长发育。所以，ATPSb基因参与的是细胞线粒体中ATP的合成，NlAtg3基因参与的是细胞的自噬过程，两个基因分属不同的细胞生理过程，作为褐飞虱防治的不同靶标，二者有本质的不同。以下结合附图和具体实施方式对本专利技术做进一步的说明。实施例11材料与方法1.1供试褐飞虱供试褐飞虱种群为感虫水稻品种TN1上饲养的Tn种群，由本实验室连续在TN1上饲养60代以上，饲养温度为26±2℃，相对湿度为80%±5%，光周期为12L:12D。主要试剂TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit，TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit，PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser，DNA2000Marker，PremixTaq™（TaKaRaTaq™Version2.0plusdye），SYBRPremixExTaq均购自大连TaKaRa公司，SMARTer®RACE5’/3’KitUserManual购自美国Clontech公司，MEGAscript®T7HighYieldTranscriptionKit购自美国Ambion公司，测序以及引物合成有由上海桑尼生物科技有限公司完成。褐飞虱NlAtg3基因全长cDNA的克隆收集TN1水稻上不同龄期的褐飞虱若虫和成虫混合材料，立即放入液氮中冻存。取样时若虫取30-50只，成虫取5只。使用TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit提取总RNA，具体步骤参照其说明书进行。使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000（Thermo）对RNA进行完整性及纯度检测。以1μg总RNA为模板，使用PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser试剂盒反转录合成cDNA，贮存于-20℃备用。根据本实验室的转录组测序序列信息，获得褐飞虱NlAtg3基因的部分核心序列，并经NCBI网站序列比对鉴定。应用PrimerPremier5.0软件设计引物NlAtg3-F和NlAtg3-R（表1），对核心序列进行验证。以TN1上不同龄期的混合褐飞虱cDNA为模板，验证其核心序列。NlAtg3全长cDNA的克隆参照Haoetal（2015）的方法，PCR扩增反应体系为50μL，其中包括PCRMix25μL，10μmol/L正反引物各2μL，cDNA模板2μL，ddH2O19μL。PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃3min,30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用TaKaRaMiniBESTAgaros本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种褐飞虱

【技术特征摘要】
1.一种褐飞虱NlAtg3基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该基因是褐飞虱正常生存所必需，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。2.一种如权利要求1所述的褐飞虱NlAtg3基因编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。3.一种如权利要求1所述的褐...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝培应，俞晓平，冯娅琳，俞飞飞，马正，申屠旭萍，张蓬军，许益鹏，王正亮，刘光富，杨倩倩，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33