本发明专利技术公开了一种猪笼草wcor413‑like蛋白，所述猪笼草wcor413‑like蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术在热带植物猪笼草中克隆得到了一个wcor413‑like蛋白基因，该wcor413‑like蛋白在冷诱导条件下大量表达，表达丰度高，具有抵抗植物低温胁迫的应用潜力，其中wcor413‑like蛋白的一个突变体还具有抗虫的功能。
Wcor413-like protein of pitcher grass and its application
The invention discloses a pitcher grass wcor413*like protein, and the amino acid sequence of the pitcher grass wcor413*like protein is shown in the sequence table SEQ ID NO:1. The invention clones and obtains a wcor413 like protein gene in a tropical plant, which is abundantly expressed under cold-induced conditions and has high expression abundance, and has the application potential of resisting plant cold stress. A mutant of wcor413 like protein also has the function of insect resistance.
【技术实现步骤摘要】
猪笼草wcor413-like蛋白及其应用
本专利技术属于生物化学与分子生物学
，具体涉及一种猪笼草wcor413-like蛋白及其在抗寒中的应用。
技术介绍
植物对环境的改变具有适应力和抵抗力，在众多的不良环境因素中，温度是限制植物生长、发育的最重要因素。研究发现，植物经历逐渐降低的温度能够提高其抗寒能力，这一过程被称为低温驯化。植物的低温驯化包括许多生理和分子反应。植物抗寒的生理生化反应是由于低温改变基因表达所引起的，目前已经克隆了许多抗寒相关基因。探索植物抗寒性的遗传机理不仅在基础理论上具有重要意义，在解决生产实际问题上也具有广泛的应用价值。植物抗寒基因表达是一种诱发性的基因表达，以避免或减轻低温对植物造成的伤害，增加植物的抗寒性。这些基因的克隆对于研究植物的抗寒分子机理及作物的抗寒育种具有重要意义。Siminovitch和Briggs(1949)最早发现植物低温诱导蛋白，随后Weiser提出了“植物抗冷性诱导过程是基因表达改变”的观点。Guy等(1990)发现菠菜在5℃诱导下有新mRNA出现，为Weiser的观点提供了有力的证据。目前已经分离并鉴定的低温诱导基因有：拟南芥的lti140、lti78、lti68、rab18、rd28、rd29和cor15a，大麦的hva1、blt101和blt14，小麦的wcs120和cor39，以及水稻的lip15等，这些低温诱导基因除受低温应答外，有些还对ABA、盐、水分胁迫等作出应答。猪笼草(Nepenthessp.)属于热带食虫植物，原产地主要为旧大陆热带地区。其拥有一个独特的吸取营养的器官-捕虫笼，捕虫笼呈圆筒形，下半部稍膨大，笼口上具有盖子，因其形状像猪笼而得名。猪笼草作为一种热带植物，对温度变化比较敏感，低温会导致其分泌大量的低温诱导蛋白，尚没有报道猪笼草低温诱导蛋白克隆及应用的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪笼草wcor413-like蛋白及其在抗寒中的应用。本专利技术在猪笼草(Nepenthessp.)中克隆得到了一个植物家族wcor413-like冷诱导蛋白，并研究其在植物抗寒中的应用。一种猪笼草wcor413-like蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：1)自序列表中SEQIDNO：1所示的氨基酸残基序列；2)将自序列表中的SEQIDNO：1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白质。所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因序列如序列表SEQIDNO：2所示。一种含所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因载体。含有所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因载体的工程菌。扩增所述的猪笼草wcor413-like蛋白的基因中任一片段的引物。一种猪笼草wcor413-like蛋白突变体，所述猪笼草wcor413-like蛋白突变体的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：3所示；突变位点为蛋白的氨基酸序列第40，41位氨基酸残基由IM突变为TT。所述猪笼草wcor413-like蛋白突变体的基因序列如序列表SEQIDNO：4所示。所述猪笼草wcor413-like蛋白或所述猪笼草wcor413-like蛋白突变体在植物抗寒中的应用。所述猪笼草wcor413-like蛋白突变体在植物抗虫中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术在热带植物猪笼草中克隆得到了一个wcor413-like蛋白基因，该wcor413-like蛋白在冷诱导条件下大量表达，表达丰度高，具有抵抗植物低温胁迫的应用潜力，其中wcor413-like蛋白的一个突变体还具有抗虫的功能。附图说明图1为本专利技术猪笼草wcor413-like蛋白基因鉴定电泳图；图中，Maker：1kbMaker，1.p2301-Nwcor413(13120bp)，2.p2301-Nwcor413/EcoRI+HindIII(1541bp+11579bp)。图2为本专利技术构建的pCAMBIA2301-Nwcor413载体结构示意图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1猪笼草wcor413-like蛋白的克隆根据烟草(Nicotianatabacum)的wcor413-like蛋白(LOC107779465)基因保守区序列设计简并引物：Fw:5’-attgattcagatttgaaggaaatt-3’(SEQIDNO：5)；Rv:5’-acgatcccaacagtgtttgaaat-3’(SEQIDNO：6)；利用同源克隆技术以提取的猪笼草RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR扩增获得了约500bp的基因片段，然后通过3’和5’RACE技术克隆得到了该基因的全长cDNA序列，序列分析表明：该基因cDNA全长为913bp(SEQIDNO:7)，开放读码框为612bp，编码204个氨基酸的前体蛋白(电泳图检测如图1所示)。该猪笼草低温诱导基因命名为Nwcor413。下面详细阐述Nwcor413基因的克隆过程。1.反转录生成cDNA第一链(1)在0.2mL离心管中加入下列试剂：总RNA2μg，500μg/mL锚定引物oligod(T)151μL，补水至15μL，70℃变性5min，迅速置冰上冷却。(2)按顺序加入下列组分：AMV5×ReactionBuffer5μL；dNTPMix,10mM1.5μL；RnaseInhibitor0.5μL；RNA5μL；AMVRT1μL；oligodT1μL；MgCl24μL，补水至20μL。(3)混匀后42℃温浴30min，然后99℃温浴5min，最后置于5℃环境中。2.PCR反应获得中间片段(1)配制PCR反应液：10xPCRbuffer(含Mg2+)6μL；反转录cDNA2μL；Taq酶0.8μL；Fw引物1.5μL；Rv引物1.5μL；dNTPMix2μL；补水至50μL。(2)PCR反应：94℃预热3min；94℃30s,55℃30s,72℃45s,上述步骤35个循环；72℃延伸10min。3.3’RACE按照Invitrogen公司3’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds,Version2.0操作说明书进行。(1)反转录反应体系如下：RNA1μg；3′RACE反转录引物(5μM)1μL；5×反转录酶缓冲液2μl；dNTPMixture(10mM)1μl；Rnase抑制剂(40U/μl)0.25μl；反转录酶(150U/μl)0.3μl；无RNase的去离子水5μl；总体积10μl。(2)反应条件如下：30℃10min；42℃60min；99℃5min；5℃5min。(3)套式PCR反应。使用TaKaRaLA(TaKaRaCode：DRR02AM)进行PCR反应时的实验操作如下：第一轮PCR反应，反应体系如下：上述的反转录反应液10μL；基因特异引物1(10μM)2μL；3’RACE一轮引物(10μM)2μL；10×LATaqBufferII5μL；10×LATaqBufferII5μL；MgCl(25mM)3μL；LA(5U/μL)0.5μL；去离子水27.5μL；总体积50μL；反应条件如下：96℃预热6min；9本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪笼草wcor413‑like蛋白，其特征在于，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：1）自序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列；2）将自序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种猪笼草wcor413-like蛋白，其特征在于，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：1）自序列表中SEQIDNO：1所示的氨基酸残基序列；2）将自序列表中的SEQIDNO：1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白质。2.根据权利要求1所述猪笼草wcor413-like蛋白，其特征在于，所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因序列如序列表SEQIDNO2所示。3.一种含权利要求1所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因载体。4.含有权利要求3所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因载体的工程菌。5.扩增权利要求1所述的猪笼草wcor413-...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐立利，
申请(专利权)人：北京大宏利辉生物科技中心，
类型：发明
国别省市：北京,11
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