一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用。所述试剂盒中包括：(1)溶酪大球菌间接血凝抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液。本发明专利技术提供的一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用，其有益效果包括以下方面：试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用；本发明专利技术中的试剂盒在检测样品时只需要使用几种简单耗材以及温箱，即使在条件比较简陋的养殖场也可以使用；结果判定直观，眼观即可；操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；成本低廉，经济实惠，使用者均可接受。

【技术实现步骤摘要】
一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用
本专利技术属于检测试剂盒领域，具体涉及一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备和应用。
技术介绍
溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)属于巨球菌属，该属包括7个菌种，溶酪大球菌是其中的代表菌种。该菌可特异性的从动物皮和动物类食品中分离到，比如牛乳、生牛肉、鸡肉、火腿等，我国传统肉制品广式腊肠中也能分离到。该菌可引起鱼发病，已从牙鲆、鲭鱼、加州鲈等鱼体内分离到，给水产养殖带来了危害。另外，溶酪大球菌还可以使犬发病，表现鼻炎的症状。该菌还携带耐甲氧西林的SCCmec原件(mecB-carryingSCCmecelement)，表现对青霉素类药物高度耐药。本研究团队首次从鸭体内分离到多株溶酪大球菌，并且所分离到的菌株均对环丙沙星高度耐药，提示在对溶酪大球菌导致的临床动物的治疗中环丙沙星无效。目前国内外对溶酪大球菌的研究报道甚少，GenBank基因库中仅有一株溶酪大球菌的全序列，对于溶酪大球菌的分子生物学检测技术报道的非常少，对于溶酪大球菌的血清抗体检测技术在国内外均未见报道。鉴于此，有必要开发一种可检测溶酪大球菌血清抗体的免疫学技术，用来对溶酪大球菌的感染状况进行调查。
技术实现思路
针对上述问题和现有技术的不足，本专利技术提供一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测技术，用来对溶酪大球菌的感染状况进行检测，另外可对鸭体内溶酪大球菌开展流行病学调查。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒，所述的试剂盒包括：(1)溶酪大球菌间接血凝抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液。进一步地，上述用来制备溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗原的溶酪大球菌菌株为来源于鸭的田间分离株，于2018年03月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，菌株保藏编号为CCTCCNO:M2018116，保藏名称：溶酪大球菌MCSD(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)。进一步地，上述的溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗原是将溶酪大球菌CCTCCM2018116株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。进一步地，上述的溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)静脉采集绵羊红细胞，与灭菌阿氏液混匀并保存，在4℃静置3～5天，使红细胞充分沉淀，然后对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和质量体积百分比为1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液，最后将制备好的绵羊红细胞用浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至体积百分比为5％的浓度，得到绵羊红细胞悬液；(2)将溶酪大球菌CCTCCM2018116株的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；(3)以步骤(2)得到的用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(1)得到的绵羊红细胞悬液，得到溶酪大球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为100μg/ml～200μg/ml。进一步地，上述的标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的溶酪大球菌CCTCCM2018116株的甘油菌，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃，5％CO2箱中培养15～20h，再挑取单菌落接种于5ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18h，然后取2ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养8～10h，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml磷酸盐缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用的溶酪大球菌菌液；再将其置于碎冰中，放在超声破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液以6000r/min的速率离心15min，取上清与弗氏完全佐剂等体积混匀，对鸭进行第一次免疫，然后取上清与弗氏不完全佐剂等体积混匀，对鸭进行第二次或二次以上的免疫，得到分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为标准阳性血清。进一步地，上述的标准阴性血清的制备方法为：收集体重2～2.5公斤未感染溶酪大球菌的健康樱桃谷鸭的颈动脉血，室温过夜，然后以3000r/min的速率离心15min，取血清即得标准阴性血清。进一步地，上述一种溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒中稀释液的制备方法为：配制浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1％的兔血清和质量体积百分比为0.01％的叠氮钠，即为稀释液。另外本专利技术还提供了上述一种溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒在检测溶酪大球菌血清抗体效价中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一种溶酪大球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法和应用，其优越性包括以下方面：a.试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医相关单位以及养殖场广泛推广使用。本专利技术中的试剂盒在检测样品时只需要110°血凝板、移液器、移液器枪头和玻璃板等简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养殖场也可以使用；b.检测快速，结果判定直观，眼观即可；c.操作简单，操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；d.成本低廉，经济实惠，使用者均可接受。附图说明图1为溶酪大球菌间接血凝抗原检测标准阳性血清、标准阴性血清以及腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的阳性血清；其中“+”表示检测标准阳性血清，“-”表示检测标准阴性血清，“空白”表示不加血清的空白对照，“腐生”表示检测腐生葡萄球菌的阳性血清，“松鼠”表示检测松鼠葡萄球菌的阳性血清，“金黄”表示检测金黄色葡萄球菌的阳性血清；“粪肠”表示检测粪肠球菌的阳性血清；“屎肠”表示检测屎肠球菌的阳性血清，1:2～1:512表示血清的稀释倍数。溶酪大球菌间接血凝抗原检测对应的标准阳性血清，检测到的血清抗体效价为1:512；检测标准阴性血清、空白对照均成立；检测腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌的阳性血清，结果均为阴性。图2为琼脂扩散试验检测溶酪大球菌标准阳性血清和标准阴性血清，其中1:2～1:32表示血清的稀释倍数。该试验检测到的标准阳性血清抗体效价为1:32，标准阴性血清无琼扩条带出现。具体实施方式下面将结合说明书附图对本专利技术实施例中的技术方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：(1)溶酪大球菌间接血凝抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液。

【技术特征摘要】
1.一种溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：(1)溶酪大球菌间接血凝抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液。2.如权利要求1所述的一种溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的用来制备溶酪大球菌间接血凝抗原的溶酪大球菌菌株保存于中国典型培养物保藏中心，菌株编号CCTCCM2018116。3.如权利要求2所述的一种溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的溶酪大球菌间接血凝抗原是将溶酪大球菌CCTCCM2018116株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。4.如权利要求3所述的一种溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的溶酪大球菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)静脉采集绵羊红细胞，与灭菌阿氏液混匀并保存，在4℃静置3～5天，使红细胞充分沉淀，然后对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和质量体积百分比为1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为浓度0.1M，pH7.2的磷酸盐缓冲液，最后将制备好的绵羊红细胞用磷酸盐缓冲液悬浮至体积百分比为5％的浓度，得到绵羊红细胞悬液；(2)将溶酪大球菌CCTCCM2018116株的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；(3)以步骤(2)得到的用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(1)得到的绵羊红细胞悬液，得到溶酪大球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为100μg/ml～200μg/ml。5.如权利要求1所述的一种溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus，MCSD)间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑福英，陈启伟，宫晓炜，刘永生，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62