利用RAD-seq对胚胎进行PGS分析的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用RAD‑seq对胚胎进行PGS分析的方法，利用限制性酶切位点相关DNA测序的方法对囊胚的滋养层细胞进行染色体非整倍体分析，包括(1)获取囊胚活检细胞；(2)构建细胞的RAD‑seq测序文库；(3)测序。本发明专利技术采用“试管婴儿”操作中的囊胚的滋养外胚层为原料，对胚胎的染色体非整倍性状况进行分析，为在辅助生殖中选择“正确”的胚胎提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
利用RAD-seq对胚胎进行PGS分析的方法
本专利技术涉及生物医学和分子细胞生物学领域，具体涉及一种利用限制性酶切位点相关DNA测序的方法，其利用该分析技术对囊胚滋养外胚层解析胚胎染色体状态。
技术介绍
简化基因组测序(Reduced-representationsequencing)是一类利用不同方法得到目的基因组的部分区域，并对这些区域进行测序，从而反映基因组一部分序列结构信息的一种新兴的测序技术，其与全基因组测序相比具有低成本优势(参见文献石璇，王茹媛，唐君等。利用简化基因组技术分析甘薯种间单核苷酸多态性.作物学报,2016,42(5):641-647)。紧随技术的发展，简化基因组测序产生了多种不同的方法，限制性酶切位点相关的DNA测序(Restriction-siteassociatedDNASequencing,RAD-seq)，复杂度降低的多态序列测序(Complexityreductionofpolymorphicsequencing，CRoPS)，基因分型测序(Genotypingbysequencing，GBS)，其中RAD-seq为最具有代表性的方法(参见文献DaveyJL,BlaxterMW.RADSeq:next-generationpopulationgenetics.BriefFunctGenomic,2010,9(5-6):416–423；AltshulerD,PollaraVJ,CowlesCR,vanEttenWJ,BaldwinJ,LintonL,LanderES.AnSNPmapofthehumangenomegeneratedbyreducedrepresentationshotgunsequencing.Nature,2000,407(6803):513–516；ElshireRJ,GlaubitzJC,SunQ,PolandJA,KawamotoK,BucklerES,MitchellSE.Arobust,simplegenotypingby-sequencing(GBS)approachforhighdiversityspecies.PloSONE,2011,6(5):e19379)。目前，RAD-seq已成功应用于SNP标记的开发、动植物重要经济性状的QTL定位、超高密度遗传图谱的构建、群体遗传结构、系统演化分析和辅助全基因组denovo测序等研究领域(参见文献EmersonKJ,MerzCR,CatchenJM,HohenlohePA,CreskoWA,BradshawWE,HolzapfelCM.Resolvingpostglacialphylogeographyusinghigh-throughputsequencing.ProcNatlAcadSciUSA,2010,107(37):16196–16200)。胚胎植入前非整倍体筛查(PreimplantGeneticScreening,PGS)是辅助生殖中第三代试管婴儿技术的核心技术。通过PGS分析，可以将胚胎中携带有各种非整倍体变异(CVN)的胚胎筛选掉，选择核型正常的胚胎进行移植，大大提高辅助生殖的成功率。目前用于PGS分析的技术都是基于单细胞全基因组扩增(WGA)建库技术上的。目前主流的WGA技术主要有三种，包括MDA、MALBAC、SurePlex(也称PicoPlex,原理与MALBAC类似)技术。这三种方法，各有优缺点，都能够用于PGS分析，且称为目前业界的主流产品。而关于MDA和MALBAC技术的优缺点(参见文献张静，吕睿，吕永焕等.胚胎植入前遗传学诊断和筛查的研究进展.国际生殖健康/计划生育杂志,2015,34(3):243-247)，MDA技术存在的缺陷是：(1)当起始模板量很少时，产物的覆盖率和准确率均会下降。(2)ADO发生率较高。MALBAC技术的缺点为：(1)不能检测到大约1/3的单核苷酸变异。(2)进行DNA复制的酶易出错，导致在扩增过程中可能会出现并不存在于细胞中的变异。SurePlex技术相较于其他两种技术，操作简单快速，高稳定性和可重复性，已经成为目前PGS扩增的标准。本专利技术以RAD-seq技术为基础，不需要进行WGA，直接从单细胞级别起始DNA构建测序文库，建立了一套不同于目前三大技术的利用囊胚期胚胎滋养外胚层细胞进行染色体检测的技术体系，本方法的优势在于，比目前市场上所使用的PGS技术的成本低；其与目前市场上公认的SurePlex-veriseq的检测效果一致，在检测精度及可信性上甚至更优。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种利用RAD-seq对胚胎进行PGS分析的方法，按照先后顺序包括以下步骤：步骤(1)：体外培养受精卵，从囊胚的滋养我胚层提取细胞；步骤(2)：将步骤(1)提取的细胞样本进行酶裂解，裂解得到的产物进行酶切、末端修复及加A、接头连接与接头开环处理、PCR扩增、纯化与第二次扩增，最后回收目的产物，即完成细胞RAD-seq测序文库的构建；步骤(3)：对步骤(2)构建的RAD-seq测序文库进行测序。优选的是，步骤(1)中，所述受精卵的获取方法如下：选取合格的MⅡ期成熟卵细胞，尽可能将附着于卵细胞外的颗粒细胞拆除，再选取健康的精子，采用单精子注射获得受精卵。在上述任一方案中优选的是，步骤(1)的具体实施步骤为：将受精卵在G1培养基中培养至卵裂球期后，将胚胎于G2培养基内洗涤数次，然后转入G2新鲜的囊胚培养基微滴中，每个微滴培养一个胚胎，培养到囊胚成熟期，选取滋养外胚层细胞。在上述任一方案中优选的是，步骤(2)，酶裂解过程中，选取的裂解酶为蛋白酶K、QiagenProtease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或溶菌酶中的一种或多种，所述裂解酶的浓度为1-30μg/ml；选用的裂解缓冲液为BufferA溶液，所述BufferA溶液的主要成分包括2-200mMTris-EDTA、1-50mMKCl、0.1wt％-5wt％的表面活性剂，所述表面活性剂为：TritonX-100、SDS、Tween-20、NP40中的一种或多种；酶裂解过程中，孵育温度为37-65℃，时间为30min-12h，失活温度不超过80℃，时间为10-45min。在上述任一方案中优选的是，步骤(2)，酶切过程中，选用的酶为MspⅠ、ApekI、EcoRI、XmaI、TaqαI、HindIII中的一种或多种的组合，选用的缓冲液BufferB包括：10-40mMTris-acetate，1-10mMMagnesiumAcetate,1-100mMPotassiumAcetate，0.1-1mg/mlBSA，酶切的温度为37℃-75℃，时间1-6小时，失活温度80℃，时间10-30min。在上述任一方案中优选的是，步骤(2)，末端修复和加A过程中，均使用DNA聚合酶Klenow片段，缓冲液为BufferB缓冲液，反应温度为37℃，修复时间为20-60min，60-80℃失活5-30min。在上述任一方案中优选的是，步骤(2)，接头连接过程的详细操作如下：使用U型接头，用T4DNA连接酶连接，16℃预连接30min，然后4℃连接过夜或不低于8小时，连接完成后50-7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用RAD‑seq对胚胎进行PGS分析的方法，按照先后顺序包括以下步骤：步骤(1)：体外培养受精卵，从囊胚的滋养我胚层提取细胞；步骤(2)：将步骤(1)提取的细胞样本进行酶裂解，裂解得到的产物进行酶切、末端修复及加A、接头连接与接头开环处理、PCR扩增、纯化与第二次扩增，最后回收目的产物，即完成细胞RAD‑seq测序文库的构建；步骤(3)：对步骤(2)构建的RAD‑seq测序文库进行测序。

【技术特征摘要】
1.一种利用RAD-seq对胚胎进行PGS分析的方法，按照先后顺序包括以下步骤：步骤(1)：体外培养受精卵，从囊胚的滋养我胚层提取细胞；步骤(2)：将步骤(1)提取的细胞样本进行酶裂解，裂解得到的产物进行酶切、末端修复及加A、接头连接与接头开环处理、PCR扩增、纯化与第二次扩增，最后回收目的产物，即完成细胞RAD-seq测序文库的构建；步骤(3)：对步骤(2)构建的RAD-seq测序文库进行测序。2.根据权利要求1所述的利用RAD-seq对胚胎进行PGS分析的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述受精卵的获取方法如下：选取合格的MⅡ期成熟卵细胞，尽可能将附着于卵细胞外的颗粒细胞拆除，再选取健康的精子，采用单精子注射获得受精卵。3.根据权利要求1所述的利用RAD-seq对胚胎进行PGS分析的方法，其特征在于，步骤(1)的具体实施步骤为：将受精卵在G1培养基中培养至卵裂球期后，将胚胎于G2培养基内洗涤数次，然后转入G2新鲜的囊胚培养基微滴中，每个微滴培养一个胚胎，培养到囊胚成熟期，选取滋养外胚层细胞。4.根据权利要求1所述的利用RAD-seq对胚胎进行PGS分析的方法，其特征在于，步骤(2)，酶裂解过程中，选取的裂解酶为蛋白酶K、QiagenProtease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或溶菌酶中的一种或多种，所述裂解酶的浓度为1-30μg/ml；选用的裂解缓冲液为BufferA溶液，所述BufferA溶液的主要成分包括2-200mMTris-EDTA、1-50mMKCl、0.1wt％-5wt％的表面活性剂，所述表面活性剂为：TritonX-100、SDS、Tween-20、NP40中的一种或多种；酶裂解过程中，孵育温度为37-65℃，时间为30min-12h，失活温度不超过80℃，时间为10-45min。5.根据权利要求1所述的利用RAD-seq对胚胎进行PGS分析的方法，其特征在于，步骤(2)，酶切过程中，选用的酶为MspⅠ、ApekI、EcoRI、XmaI、TaqαI、HindIII中的一种或多种的组合，选用的缓冲液BufferB包括：10-40mMTris-acetate，1-10mMMagnesiumAcetate...

【专利技术属性】
技术研发人员：张癸荣，费嘉，金治平，王云云，蔡旺庭，刘威达，
申请(专利权)人：北京中仪康卫医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11