绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂技术

本发明专利技术提供绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂，涉及微生物农药领域。绿色木霉发酵方法，包括如下步骤：将绿色木霉LTR‑2接种至发酵培养基，发酵前期控制温度为29‑31℃，发酵后期控制温度为24℃‑26℃、pH为5.0～5.5，得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR‑2发酵液。采用本发明专利技术方法，能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液，显著提高产品的抗逆性，延长货架期；其水分散粒剂对番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病的防治效果明显优于对照药剂和农用制剂DZ‑1。

【技术实现步骤摘要】
绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂
本专利技术涉及微生物农药领域，更具体地说是涉及绿色木霉发酵方法及其水分散粒剂。
技术介绍
木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。绿色木霉菌（Trichodermaviride）在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉菌能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。在植物病理生物防治中具有重要的作用。绿色木霉菌是所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物有降解作用，效果非常好。大多数绿色木霉菌可产生多种对植物病原真菌、细菌及昆虫具有拮抗作用的生物活性物质，并能提高农作物的抗逆性，促进植物生长和提高农产品产量，因此被广泛用于生物防治、生物肥料及土壤改良剂。由于化学农药对环境的负面影响较为严重，所以对环境较为友好的绿色木霉菌受到了广泛的关注。厚垣孢子（chlamydospore）又称厚壁孢子。它是由菌丝中间的个别细胞膨大，原生质浓缩和细胞壁变厚而形成的变态菌丝，既不是无性孢子，也不是有性孢子。厚垣孢子呈圆形、纺锤形或长方形，它是真菌度过不良环境的一种休眠细胞，寿命较长，菌丝体死亡后，上面厚垣孢子还活着，一旦环境条件好转，又能萌发成菌丝体。分生孢子（conidiospore）是真菌中常见的一类无性孢子，是生于细胞外的孢子，所以称为外生孢子。分生孢子着生与已分化的分生孢子梗（conidiophore）或具有一定形状的小梗上，也有些真菌的分生孢子就着生在菌丝的顶端。跟分生孢子相比，厚垣孢子存在抗逆性强、货架期长等优点，但是现有技术发酵培养绿色木霉LTR-2，仅能得到富含分生孢子的发酵液。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供绿色木霉发酵方法，能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液，显著提高产品的抗逆性，延长货架期。本专利技术的再一目的是提供绿色木霉的水分散粒剂。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。绿色木霉发酵方法，包括如下步骤：将绿色木霉LTR-2接种至发酵培养基，发酵前期控制温度为29-31℃，发酵后期控制温度为24℃-26℃、pH为5.0～5.5；发酵结束后，得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液；所述发酵培养基含有如下成分：玉米粉18～22g/L、葡萄糖8～12g/L、磷酸二氢钾7～8g/L、碳酸钙4～6g/L、硝酸钠0.8～1.2g/L、硫酸铵1～2g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、七水硫酸亚铁0.4～0.6g/L、硫酸锰0.15～0.25g/L、硫酸锌0.15～0.25g/L，pH为6.0～7.0。在本专利技术中，所述发酵前期是自发酵开始至发酵后65-72h，发酵后期是发酵后72h-发酵后178h。在本专利技术中，将绿色木霉LTR-2种子液接种至发酵培养基。在本专利技术中，所述发酵液是将绿色木霉LTR-2接种至液体种子培养基，在25-30℃条件下培养2~3d，得到绿色木霉LTR-2种子液；所述液体种子培养基是将马铃薯切块，加蒸馏水，煮沸后取滤液，加入葡萄糖，搅拌后所得。本专利技术还提供采用上述方法得到的发酵液。本专利技术还提供绿色木霉分散粒剂，采用如下方法制备：（1）将富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液浓缩；（2）在浓缩液中添加润湿剂、分散剂、崩解剂和填料，混合均匀后，粉碎、造粒、干燥、筛分，得到所述水分散粒剂。优选的技术方案中，所述润湿剂为十二烷基硫酸钠、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、萘磺酸盐和十八烷基丁二酸钠中的一种或两种以上；所述分散剂为木质素磺酸盐、萘磺酸钠甲醛缩合物、烷基酚乙氧基化合物、多芳基酚乙氧基化磷酸酯、EO–PO嵌段共聚物和聚羧酸盐中的一种或两种以上；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡络烷酮、交联羧甲基纤维素钠中的一种或两种以上；所述填料为粘土、高岭土、膨润土、白炭黑、硅藻土、滑石粉中的一种或两种以上。优选的技术方案中，所述绿色木霉菌LTR-2水分散粒剂中润湿剂的质量百分含量为1~5%、分散剂的质量百分含量为2~10%、崩解剂的质量百分含量为2~5%。在本专利技术中，所述绿色木霉分散粒剂中绿色木霉LTR-2含量至少为25×108cfu/g。采用本专利技术绿色木霉发酵方法，能够获得富含厚垣孢子的绿色木霉发酵液，显著提高产品的抗逆性，延长货架期。本专利技术绿色木霉的水分散粒剂，能够使绿色木霉LTR-2进入水中分散并防止重新再聚集，保证呈悬浮状态，对番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、烟草白粉病的防治效果明显优于对照药剂和农用制剂DZ-1。具体实施方式实施例1绿色木霉LTR-2厚垣孢子发酵液的制备本实施例介绍了绿色木霉LTR-2厚垣孢子发酵液的制备。1、绿色木霉LTR-2的活化从绿色木霉LTR-2的斜面中，用无菌接种针挑取部分菌苔至已预制好的含有PDA固体培养基的茄子瓶中，30℃培养2d，得到活化的绿色木霉LTR-2。2、绿色木霉LTR-2种子液的制备用无菌接种针挑取活化后的绿色木霉LTR-2菌苔，接种到装有100mL液体种子培养基的三角烧瓶（500mL规格）中。培养条件：在28℃、100~150r/min的摇床中，遮光震荡培养2~3d，得到绿色木霉LTR-2种子液。其中液体种子培养基采用如下方法制备：将300g去皮马铃薯切块，加800mL蒸馏水，煮沸10～20min，用纱布过滤，在滤液中加入20g葡萄糖，搅拌至葡萄糖溶解后，补加蒸馏水至1000mL，分装后121℃高压灭菌20min。3、制备绿色木霉LTR-2发酵液发酵培养基含有如下成分：玉米粉20g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾7.5g/L、碳酸钙5g/L、硝酸钠1g/L、硫酸铵1.5g/L、氯化钠1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、七水硫酸亚铁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸锌0.2g/L，pH为6.5。按照2%的接种量将绿色木霉LTR-2种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中。发酵前期（自发酵开始至发酵后72h），控制发酵温度为30℃、转速150r/min、通气量为1VVM；发酵后期（发酵后72h至发酵后168h），控制发酵温度为25℃、转速150r/min、通气量为1VVM，通过流加稀酸控制发酵液pH为5.0～5.5。发酵结束后，得到厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液。去掉上述发酵培养基中的七水硫酸镁和七水硫酸亚铁，其他培养基成分和含量不变，作为对照发酵培养基。按照2%的接种量将绿色木霉LTR-2种子液接入装有对照发酵培养基的发酵罐中。整个发酵过程，发酵温度一直控制在30℃、转速150r/min、通气量为1:1；一直持续到发酵结束，得到分生孢子含量为5×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2菌液，几乎无厚垣孢子产生。实施例2绿色木霉LTR-2水分散粒剂的制备在厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液（实施例1制备）中，加入助滤剂后通过过滤或加入絮凝剂后离心得到厚垣孢子浓缩物。例如：向1200kg厚垣孢子含量为15×108cfu/mL的绿色木霉LTR-2发酵液中加入絮凝剂聚丙烯酰胺（按照2g/kg的比例添加），混合均匀后，在蝶式离心机中，5000rpm转速下离心浓缩，取沉淀，得到210kg厚垣孢子浓缩物。在210kg厚垣孢子浓缩物中，添加10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.绿色木霉发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将绿色木霉LTR‑2接种至发酵培养基进行培养，发酵前期控制温度为29‑31℃，发酵后期控制温度为24℃‑26℃、pH为5.0～5.5；发酵结束后，得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR‑2发酵液；所述发酵培养基含有如下成分：玉米粉18～22g/L、葡萄糖8～12g/L、磷酸二氢钾7～8g/L、碳酸钙4～6g/L、硝酸钠0.8～1.2g/L、硫酸铵1～2g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、七水硫酸亚铁0.4～0.6g/L、硫酸锰0.15～0.25g/L、硫酸锌0.15～0.25g/L，pH为6.0～7.0。

【技术特征摘要】
1.绿色木霉发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将绿色木霉LTR-2接种至发酵培养基进行培养，发酵前期控制温度为29-31℃，发酵后期控制温度为24℃-26℃、pH为5.0～5.5；发酵结束后，得到富含厚垣孢子的绿色木霉LTR-2发酵液；所述发酵培养基含有如下成分：玉米粉18～22g/L、葡萄糖8～12g/L、磷酸二氢钾7～8g/L、碳酸钙4～6g/L、硝酸钠0.8～1.2g/L、硫酸铵1～2g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、七水硫酸亚铁0.4～0.6g/L、硫酸锰0.15～0.25g/L、硫酸锌0.15～0.25g/L，pH为6.0～7.0。2.根据权利要求1所述绿色木霉发酵方法，其特征在于所述发酵前期的培养时间是65h～72h，发酵后期的培养时间是95h～105h。3.根据权利要求1或2所述绿色木霉发酵方法，其特征在于将绿色木霉LTR-2种子液接种至发酵培养基。4.根据权利要求3所述绿色木霉发酵方法，其特征在于将绿色木霉LTR-2接种至液体种子培养基，在25-30℃条件下培养2~3d，得到绿色木霉LTR-2种子液；所述液体种子培养基是将马铃薯切块，加蒸馏水，煮沸后过滤，取滤液，加入葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：仇俊涛，杨合同，罗树荣，
申请(专利权)人：云南星耀生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53