一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合及其筛选方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术，特别涉及一种基于qPCR技术的内参基因组合及其筛选方法。一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合的筛选方法，设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18S rRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia的特异性引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.3‑32所示，然后以肾阳虚外感小鼠模型cDNA为模板，分别利用所述特异性引物对15个内参基因进行RT‑qPCR分析，结合组间t检验及组间平均值的绝对值比较，能方便快捷确立所述肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合为Grcc10和Ppia。本发明专利技术首次发现了针对肾阳虚外感病证最合适的qPCR内参基因组合为Grcc10和Ppia。为后续在该病证结合模型上的开展系列目标基因表达研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合及其筛选方法
本专利技术涉及分子生物学技术，特别涉及一种基于qPCR技术的内参基因组合及其筛选方法。
技术介绍
实时荧光定量PCR技术(quantitativereal-timePCR,qPCR)是一种实时监测PCR扩增产物并进行解析的定量方法，具有敏感性高、重复性好、检测速度快、自动化程度高等诸多优点，目前已被国内外学者广泛应用。该技术一般需要用表达稳定的内参基因对靶基因的表达情况进行校正和标准化。理想的内参基因应在各种试验条件下，各种类型的组织和细胞中均恒定表达，而且其表达量是近似的，无显著性差异。然而，不同类型的组织，不同的发育阶段和不同处理条件下内参基因转录水平均可能发生变化，因此，选择合适的内参基因以减少检测样本间的差异，决定了利用荧光定量PCR分析基因表达水平结果的可靠性。以往的研究多以表达量众多的内参基因如核糖体RNA18SrRNA或28SrRNA、3-磷酸甘油脱氢酶以及肌动蛋白等作为内参。然而，大量的研究表明，这些常用的内参基因在不同实验条件下的表达也有变化。不稳定内参基因的使用会导致qPCR的结果出现严重偏差。很多研究表明，一个广泛通用的内参基因是不存在的，研究者在每一个实验或物种中都需要寻找合适的稳定表达的基因作为内参。Bestkeeper、geNorm和NormFinder等广泛用作内参基因筛选软件，可帮助研究人员在不同的研究中选择稳定的内参基因，但这些软件筛选到的单内参或双内参基因都不适合用于肾阳虚外感病证肺组织的内参基因。近年来，文献多见于玉兰[8]、泽泻[9]、川续断[10]等药用植物的RT-qPCR内参基因筛选的报道越来越多，但目前尚无关于肾阳虚外感小鼠模型肺组织RT-qPCR内参基因筛选的报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的为引入了统计分析的组间t检验方法，能高效、准确地筛选到合适的双内参基因组合，可用于后续开展对肾阳虚外感病证肺组织目的基因表达的研究。为实现上述专利技术目的，采用以下技术方案：一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合，其特征在于，所述内参基因组合为Grcc10和Ppia。上述的肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合的筛选方法，首先分别设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18SrRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia的特异性引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.3-32所示，然后以肾阳虚外感小鼠模型,cDNA为模板，分别利用所述特异性引物对15个内参基因进行RT-qPCR分析，确立所述肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合。优选地，筛选方法包括以下步骤：（1）复制肾阳虚模型；（2）建立肾阳虚外感模型；（3）RT-PCR检测肺组织中H1N1的mRNA的表达；（4）提取动物组织总RNA；（5）反转录合成cDNA；（6）设计扩增引物进行RT-PCR扩增；分别设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18SrRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia，所述内参基因的特异性引物序列依次如SEQIDNO.1-30所示；（7）内参基因的RT-PCR分析；采用双基因两两组合的方法，并对两两组合的双基因在正常组和模型组之间的基因表达差异进行T检验，选择组合的P值大于0.05以上，又进行了这些组合的正常组与模型组差值的绝对值比较，筛选差值的绝对值最小的组合作为双参考基因的最优化组合，分析得Grcc10+Ppia组合基因为肾阳虚外感小鼠模型的稳定内参基因。优选地，步骤（1）所述的复制肾阳虚模型的方法为以4mL/kg腹腔注射2mg/mL苯甲酸雌二醇稀释液，每日1次，连续7d，复制肾阳虚模型。优选地，步骤（1）所述的建立肾阳虚外感模型的方法为给予麻醉后的肾阳虚小鼠滴鼻接种流感病毒H1N1鸡胚尿囊液20μL/只，正常组滴鼻等体积的生理盐水，接种病毒的小鼠隔离喂养，自由进食进水6d，解剖处死；其中鸡胚尿囊液的半数组织培养感染剂量为TCID502.34×108。优选地，步骤（6）所述的RT-PCR扩增程序为：95℃15min下进行1个循环，95℃10s和60℃32s进行40个循环。优选地，步骤（8）所述的内参基因的RT-PCR分析的具体步骤为：（1）15个内参基因引物PCR扩增；（2）15个内参基因的表达水平确定；（3）BestKeeper、geNorm和NormFinder软件对肾阳虚外感模型15个内参基因稳定性表达分析；（4）15个内参基因两两组合T检验；（5）内参基因稳定性验证；（6）得Grcc10+Ppia组合基因为肾阳虚外感小鼠模型的稳定内参基因。优选地，步骤（5）所述的用于内参基因稳定性验证所选的目标基因为TLR3、TLR4、TLE7、RIG-1；目标基因的引物序列依次如SEQIDNO.31-38所示。本专利技术在软件计算得出的单参考基因和双参考基因组合在目的基因的表达水平上与我们所筛选出的双参考基因具有一定差异，甚至出现相反的结果，因此BestKeeper、geNorm和NormFinder等软件计算的最佳参考基因和双参考基因并不能作为最稳定的参考基因。本研究在双参考基因的筛选过程中，首先通过T检验筛选出P>0.05的双基因组合，在此基础上，进一步比较两两组合后正常组和模型组差值的绝对值，以差值最小的绝对值作为两两内参基因的最优组合。通过目标基因的验证表明内参基因选择的重要性。本研究选择了15个常用的内参基因：基因丰富簇C10基因(generichcluster,C10gene,Grcc10)、β-肌动蛋白(beta-actin,Actb)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gapdh)、真核翻译起始因子4H(eukaryotictranslationinitiationfactor4H,Eif4h)、神经前体细胞表达发育下调基因8(neuralprecursorcellexpresseddevelopmentallydown-regulatedgene8,Nedd8)、环指蛋白187(ringfingerprotein187,Rnf187)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白ε肽(tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenaseactivationprotein,epsilon,Ywhae)、β-葡萄糖醛酸(beta-glucuronidase,Gusb)、α-微管蛋白(alpha-tubulin,Tuba)、β-2微球蛋白(beta-2microglobulin,β2m)、18S核糖体RNA(18SribosomalRNA,18SrRNA)、核糖体蛋白L13(RibosomalproteinL-13,RPL13)、泛素C(UbiquitinC,Ubc)、核糖体蛋白L32(RibosomalproteinL32,RPL32)、肽酰脯氨酰异构酶A(peptideacylp本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合，其特征在于，所述内参基因组合为Grcc10和Ppia。

【技术特征摘要】
1.一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合，其特征在于，所述内参基因组合为Grcc10和Ppia。2.一种权利要求1所述的肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合的筛选方法，其特征在于，首先分别设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18SrRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia的特异性引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.1-30所示，然后以肾阳虚外感小鼠模型，cDNA为模板，分别利用所述特异性引物对15个内参基因进行RT-qPCR分析，确立所述肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）复制肾阳虚模型；（2）建立肾阳虚外感模型；（3）RT-PCR检测肺组织中H1N1的mRNA的表达；（4）提取动物组织总RNA；（5）反转录合成cDNA；（6）设计扩增引物进行RT-PCR扩增；分别设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18SrRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia，所述内参基因的特异性引物序列依次如SEQIDNO.1-30所示；（7）内参基因的RT-PCR分析；采用双基因两两组合的方法，并对两两组合的双基因在正常组和模型组之间的基因表达差异进行T检验，选择组合的P值大于0.05以上，又进行了这些组合的正常组与模型组差值的绝对值比较，筛选差值的绝对值最小的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨勇，容蓉，付业佩，杨佳，范珊珊，赵绍哲，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：山东,37