【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，涉及一种dna纳米比率荧光探针及其在ursa检测中的应用。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、自然流产连续发生3次或3次以上称为复发性流产(recurrent spontaneousabortion，rsa)，其病因复杂，除染色体、内分泌、解剖、感染等因素外，约50％病因不明，称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，ursa)。ursa发病率约为育龄妇女的3％～5％，约占妊娠妇女的10％～15％，严重危害妇女生殖健康。然而，ursa的具体发病机制尚未明确，这对于ursa的早期诊断及预测、制定有效的治疗策略至关重要。mirna作为细胞内重要的活性物质，参与多种疾病(如肿瘤、心血管)的发生与发展。据专利技术人研究了解，在ursa小鼠模型中mir-374c-5p过表达显著降低胚胎吸收率，同时蜕膜中白介素6(il-6)表达降低。即，下调的mir-374c-5p通过提高il-6的表达参与ursa的发病机制。因此，对mir-374c-5p的检测对研究其具体作用机制及ursa的精准诊疗具有重要意义。
3、目前，检测microrna的常规策略主要集中在实时聚合酶链反应(rt-pcr)，原位杂交组织化学和微阵列分析，这些方法通常是费力和复杂的。此外，这些方法不适用于体内rna的检测，限制了其在
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种dna纳米比率荧光探针及其在ursa检测中的应用，本专利技术提供的纳米荧光探针不仅能够在细胞内mir-374c-5p水平精准成像，保证原位实时可视化rna，实现对ursa中mir-374c-5p的检测；而且具有灵敏度高、选择性好、稳定性好以及重现性好的优点。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
3、一方面，一种dna纳米比率荧光探针，以介孔二氧化硅(msn)作为载体负载罗丹明b(rhb)形成核结构，所述核结构表面覆盖一层聚多巴胺(pda)形成核壳结构，作为壳层的聚多巴胺表面附着cy5标记的dna1；所述dna1能够特异性识别mir-374c-5p并与之杂交互补。
4、由于msn具有巨大的比表面积、可调的介孔孔径、结构稳定、易于修饰、生物相容性好等优点，因此，如图1所示，本专利技术采用msn作为载体，然后将高量子产率的罗丹明b(rhb)作为参比染料负载其中。随后，覆盖一层pda形成核壳结构，最后，将cy5标记的dna1修饰到pda表面。在整个设计中，pda主要起到三个作用：1.将rhb封装在msn中，防止其泄露；2.由于其具有近红外强吸收，因此，可猝灭cy5的荧光；3.可通过π-π作用，与特异性识别序列dna1结合。考虑到pda的近红外吸收特性，本专利技术选择以cy5标记dna1。同时，cy5可与rhb的荧光光谱完全分开，从而避免两者之间发生能量转移。纳米比率荧光探针本身在550nm处发射荧光，当遇到mir-374c-5p时，dna1单链与其互补配对，导致cy5在670nm的荧光恢复。以两处的荧光强度比值i670nm/i550nm对mir-374c-5p进行定性定量检测，此种方法可有效避免操作及仪器等造成的误差、生物样品背景荧光的干扰，因而可以提高测量的准确性。此外，上述制备的核壳结构比率型纳米荧光探针也具有稳定性好、重现性好、可分散性强的优势。
5、另一方面，一种上述dna纳米比率荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
6、将介孔二氧化硅与罗丹明b加入至溶剂中，混合均匀，使介孔二氧化硅充分吸附罗丹明b，获得sio2@rhb；
7、将sio2@rhb制成分散液，并将分散液与多巴胺混合，使多巴胺在sio2@rhb表面进行聚合反应，形成sio2@rhb@pda纳米粒子；
8、将sio2@rhb@pda纳米粒子分散于cy5标记的dna1的溶液中，室温孵育使cy5标记的dna1结合在sio2@rhb@pda纳米粒子的表面，即得。
9、第三方面，一种上述dna纳米比率荧光探针在制备检测ursa中mir-374c-5p的试剂的应用。
10、第四方面，一种ursa中mir-374c-5p的检测试剂盒，包括上述dna纳米比率荧光探针、缓冲溶液。
11、第五方面，一种上述dna纳米比率荧光探针在原位实时检测细胞水平上mir-374c-5p的应用。
12、第六方面，一种上述dna纳米比率荧光探针在原位实时检测细胞水平上mir-374c-5p的方法，采用含有所述dna纳米比率荧光探针的溶液孵育细胞，设定时间后，进行比率荧光成像。
13、本专利技术的有益效果为：
14、(1)本专利技术的纳米比率荧光探针化学稳定性、光物理稳定性好，可高灵敏、高选择性地比率检测mir-374c-5p，并能准确成像细胞内mir-374c-5p水平变化。
15、(2)本专利技术的纳米比率荧光探针对mir-374c-5p具有超高的选择性，非匹配序列nc、核糖核酸酶(rnase)、胰蛋白酶(trypsin)、牛蛋白血清(bsa)对检测都没有干扰；探针对细胞没有毒副作用，有望用于活体内mir-374c-5p活性的检测。
16、(3)本专利技术的纳米比率荧光探针，可准确测量小鼠血清中mir-374c-5p，并通过其水平变化区分ursa及正常小鼠。
17、(4)本专利技术的纳米比率荧光探针，可有效避免仪器、操作误差以及细胞自发荧光的干扰，因此信噪比较高，这种方法能够准确实时成像监测细胞内mir-374c-5p的水平变化。
18、(5)本专利技术的纳米比率荧光探针的组装步骤简单，易于获得。
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1.一种DNA纳米比率荧光探针，其特征是，以介孔二氧化硅作为载体负载罗丹明B形成核结构，所述核结构表面覆盖一层聚多巴胺形成核壳结构，作为壳层的聚多巴胺表面附着Cy5标记的DNA1；所述DNA1能够特异性识别miR-374c-5p并与之杂交互补。
2.如权利要求1所述的DNA纳米比率荧光探针，其特征是，所述DNA1的序列为：CCG GGTAGCACTTAGCAGGTTGTATTAT ACC CGG。
3.一种权利要求1或2所述的DNA纳米比率荧光探针的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的DNA纳米比率荧光探针的制备方法，其特征是，介孔二氧化硅与罗丹明B的质量比为0.5～2:1，优选为0.9～1.1:1；
5.如权利要求3所述的DNA纳米比率荧光探针的制备方法，其特征是，
6.如权利要求3所述的DNA纳米比率荧光探针的制备方法，其特征是，
7.如权利要求3所述的DNA纳米比率荧光探针的制备方法，其特征是，室温孵育的时间为40～80min，优选为55～65min；
8.一种权利要求
9.一种URSA中miR-374c-5p的检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1或2所述的DNA纳米比率荧光探针、缓冲溶液。
10.如权利要求9所述的URSA中miR-374c-5p的检测试剂盒，其特征是，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种dna纳米比率荧光探针，其特征是，以介孔二氧化硅作为载体负载罗丹明b形成核结构，所述核结构表面覆盖一层聚多巴胺形成核壳结构，作为壳层的聚多巴胺表面附着cy5标记的dna1；所述dna1能够特异性识别mir-374c-5p并与之杂交互补。
2.如权利要求1所述的dna纳米比率荧光探针，其特征是，所述dna1的序列为：ccg ggtagcacttagcaggttgtattat acc cgg。
3.一种权利要求1或2所述的dna纳米比率荧光探针的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的dna纳米比率荧光探针的制备方法，其特征是，介孔二氧化硅与罗丹明b的质量比为0.5～2:1，优选为0.9～1.1:1；
【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，范楠楠，张振，刘鑫馗，褚楚，张云虹，李莉华，吕潇，周苗苗，朱肖肖，乔梦玫，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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