一种用于原发性胆汁肝硬化标志物检测的蛋白芯片及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测原发性胆汁肝硬化标志物的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：（1）黑玻片预处理；（2）抗原溶液点样；（3）封闭工艺；制得所述蛋白芯片。本发明专利技术蛋白芯片用于检测原发性胆汁肝硬化标志物，应用本公司独创的蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率，降低检测成本；本发明专利技术人开发了同时检测抗AMA‑M2抗体、抗AMA‑M2‑3E抗体、抗GP210抗体和抗SP100抗体4个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速，高效，低成本等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于原发性胆汁肝硬化标志物检测的蛋白芯片及其制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种用于检测原发性胆汁肝硬化标志物的蛋白芯片及其制备方法。
技术介绍
自身免疫性疾病是免疫系统对自身机体的成份发生免疫反应，造成损害而引发疾病。正常情况下，免疫系统只对侵入机体的外来物，如细菌、病毒、寄生虫以及移植物等产生反应，消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下，机体的组织成份或免疫系统本身出现了某些异常，致使免疫系统误将自身成份当成外来物来攻击。这时候免疫系统会产生针对机体自身一些成份的抗体及活性淋巴细胞，损害破坏自身组织脏器，导致疾病。如果不及时有效的加以控制，其后果十分严重：免疫系统的攻击会影响每个人体器官，且通常会终身对其进行攻击；有时还可能同时对身体众多部位造成损伤。早期诊断对管理自免来说非常重要，在早期阶段发现可避免或延迟目标器官或组织发生无法补救的损伤。原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种慢性的胆汁淤积性肝脏疾病，其特征为肝内胆小管阻塞和血清中出现高滴度的抗线粒体抗体。该病病因不清，但现有的证据表明与自身免疫有关。在英国的东部和北部地区，PBC的发病率为140例/10万。在欧洲，PBC是进行肝移植最常见的原因。PBC多见于中年女性(90％)，发病年龄在30-65岁之间。在PBC患者血清中可检出多种自身抗体，实验室检查除碱性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酸转肽酶(GGT)等明显升高及抗线粒体亚型丙酮酸脱氢酶复合物(抗AMA-M2抗体)阳性外，还有抗AMA-M2-3E抗体、抗核包膜蛋白(GP210)抗体、抗多核点(SP100)抗体等自身抗体阳性。能够迅速准确地测定出这些抗体的浓度，对原发性胆汁肝硬化的临床诊断具有重要的意义。(1)抗AMA-M2抗体抗线粒体抗体(AMA)是一种无器官特异性也无种属特异性的自身抗体，也见于其他自身免疫性疾病患者。线粒体抗原位于真核细胞线粒体膜内，抗原成分为2一氧酸脱氢酶复合体的亚单位，为一组自身抗原。AMA靶抗原分为9型(M1～M9)。M2是原发性胆汁性肝硬化患者血清中与AMA反应的主要成分。原发性胆汁性肝硬化症敏感、特异性实验，高滴度的AMA-M2在原发性胆汁性肝硬化中阳性率>90％。常用作原发性胆汁性肝硬化症的重要实验室诊断指标，但AMA与PBC的病期、疾病严重程度、治疗效果均无相关性。除PBC外，抗线粒体M2型抗体也见于慢性活动性肝炎(CAH)、HBsAg阴性的肝病。由于线粒体抗原成分复杂，对很多抗原的性质尚不了解，而原发性胆汁性肝硬化患者几乎都出现高效价抗AMA-M2。(2)抗AMA-M2-3E抗体AMA-M2-3E抗原是天然AMA-M2抗原(纯化的抗原以丙酮酸脱氢酶E2亚基为主)和重组蛋白BPO【2-酮酸脱氢酶E2亚基(BCOADH-E2)、丙酮酸脱氢酶E2亚基(PDH-E2)和2-酮戊二酸脱氢酶E2亚基(OGDH-E2)的重组融合蛋白】联合抗原检测AMAM2，灵敏度增高。(3)抗GP210抗体抗GP210抗体是表现为核膜型荧光染色型的抗核包膜蛋白抗体的一种，其靶抗原为位于核孔复合物上的210kD跨膜糖蛋白。该抗体存在于一部分原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者血清中。而抗线粒体抗体(AMA)是诊断PBC的特异性抗体，敏感性达90％，但仍有10％的PBC患者AMA抗体阴性，即AMA对PBC的诊断有一定的局限性。抗GP210抗体却可出现在AMA抗体阴性的PBC患者中，故抗GP210抗体不仅可以辅助AMA阴性PBC患者的早期诊断，还有助于病情评估与预后分析，是具有临床应用价值的检测指标。一般使用间接免疫荧光法对血清中抗GP210抗体进行检测。(4)抗Sp100抗体抗Sp100抗体是另外一种可在原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者血中检测到的抗核抗体(ANA)。免疫荧光法检测常表现为多核点型(MND)的荧光染色模型，其靶抗原为分子量100kD的可溶性酸性磷酸化核蛋白(Sp100)。抗Spl00抗体在PBC患者中的阳性率为21％～34％，在其他自身免疫性疾病中也可检出，但阳性率低。抗线粒体抗体(AMA)阴性PBC患者中60％出现抗Sp100抗体，提示此抗体对AMA阴性PBC患者的诊断价值。抗Sp100抗体对PBC患者具有较高的敏感性和特异性，在PBC患者中特异性约为97％，敏感性为10％～30％，其他肝病患者均为阴性。抗Sp100抗体亦少见于其他自身免疫性及风湿性疾病患者，阳性率一般<3％，且阳性患者多与PBC密切相关，并在临床上常出现于肝损伤之前，如原发性干燥综合征、硬皮病等。抗Sp100抗体在AMA阴性PBC患者中的阳性率为60％，显著高于AMA阳性者(20％)，该抗体对AMA阴性的PBC患者的诊断具有重要意义。此外，抗Sp100抗体与PBC疾病轻重无关。原发性胆汁肝硬化相关指标检测多采用免疫学方法，目前市场最常见的检测方法有免疫印迹法(斑点免疫、条带免疫)、酶联免疫、化学发光法等。免疫印迹法适合于自免初筛的检验，方法简单，灵敏度和特异性一般，不需要复杂的仪器，成本低，但有时候会得到无法判定的结果，需要做进一步检验，且该方法检测仅能实现定性观察；酶联免疫(ELISA)、单指标化学发光法为免疫诊断最常用的方法，灵敏度和特异性都比较高，结果可靠性较免疫印迹法提高，但对于组合项目需对每个项目进行单独的检测，检测效率较低，成本高昂。我司开发的蛋白芯片技术成功实现了多指标联合检测，可以一次性测定多个指标。有效地提高检测效率，实现定量检测、降低检测成本。且该方法具有灵敏度高、特异性好、全自动化程度高、应用范围广等优点。特别适用于这种需要一次性检测多个指标的情况。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种用于原发性胆汁肝硬化标志物检测的蛋白芯片及其制备方法。本专利技术蛋白芯片用于检测原发性胆汁肝硬化标志物，应用本公司独创的蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率，降低检测成本；本专利技术人开发了同时包含有抗AMA-M2抗体、抗AMA-M2-3E抗体、抗GP210抗体和抗SP100抗体4个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速，高效，低成本等优点。本专利技术的技术方案如下：一种用于原发性胆汁肝硬化标志物检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：(1)黑玻片预处理；(2)抗原溶液点样；(3)封闭工艺，制得所述蛋白芯片。步骤(1)中所述黑玻片预处理的方法为：①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16～24h，之后采用纯化水清洗2～8次；②将黑玻片置于质量浓度为0.05～1％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡20～60min；③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫放入烘箱中，于100～180℃条件下烘烤0.2～0.6h。步骤(2)中所述抗体溶液包括AMA-M2抗原、AMA-M2-3E抗原、GP210抗原和SP100抗原溶液。步骤(2)中所述点样的方法为机器自动化点样。步骤(3)中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1～24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。一种所述蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于原发性胆汁肝硬化标志物检测的蛋白芯片，其特征在于所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：（1）黑玻片预处理；（2）抗原溶液点样；（3）封闭工艺，制得所述蛋白芯片。

【技术特征摘要】
1.一种用于原发性胆汁肝硬化标志物检测的蛋白芯片，其特征在于所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：（1）黑玻片预处理；（2）抗原溶液点样；（3）封闭工艺，制得所述蛋白芯片。2.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（1）中所述黑玻片预处理的方法为：①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16~24h，之后采用纯化水清洗2~8次；②将黑玻片置于质量浓度为0.05~1%的硅烷溶液中浸泡20~60min；③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100~180℃条件下烘烤0.2~0.6h。3.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（2）中所述抗原溶液包括AMA-M2抗原、AMA-M2-3E抗原、GP210抗原和SP100抗原溶液。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉琛，泮锋纲，丁俊杰，施启尧，
申请(专利权)人：江苏三联生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32