一种分子层析PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种分子层析PCR检测方法，采用一种多层垂直流动型层析检测卡盒进行检测，包括：第一步，将待测样品进行PCR反应，得到PCR产物；第二步，将待测样品标记的PCR产物放置于所述检测卡盒的缀合物垫上反应，检测线或点出现紫红色沉淀带；过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫上的质控线或点，与质控线或点上的Biotin‑牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点若没有出现紫红色沉淀带，表示该检测是无效的；第三步，激活检测卡盒开关，查看结果。本发明专利技术可以消除样液回流从而防止假阳性检测结果，使检测不受样品性状、复杂基质和外来气溶胶的影响，操作简便、检测结果准确。

【技术实现步骤摘要】
一种分子层析PCR检测方法
本专利技术涉及分子生物学检测技术，特别是微生物、病毒和动物源性和种属检验技术,具体是涉及一种分子层析PCR检测方法。
技术介绍
胶体金免疫层析法(Colloidalgoldimmunochromatography)是九十年代兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的一个区带，当干燥的硝酸纤维膜一端接触样品液后，由于毛细管作用，样液将沿着该膜向前平行流动，当流动至固定有抗体的区域时，样液中相应的抗原与抗体发生特异性结合，可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。在胶体金免疫层析法的基础上，胶体金核酸层析也逐渐发展起来，通过生物素(Biotin)-生物素抗体，荧光素(FITC)-荧光素抗体，地高辛(DIG)-地高辛抗体等系统将PCR和胶体金免疫层析结合起来。目前，胶体金核酸层析并没有成熟的发展起来，已有的核酸层析试纸具有以下缺点：1.试纸外观仍然是传统的长型纸条，操作人员直接接触测试纸条，存在样品污染的情况；2.加样区和检测区处于同一水平的两个区域，通过经毛细管侧向流的方式进行检测，存在样液回流的情况；3.侧向流导致检测时间过长，降低检测灵敏度。样液回流导致假阳性结果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种方便操作和显著提高检测准确度和灵敏度的分子层析PCR检测方法，解决现有胶体金核酸层析试纸所具有的上述问题和缺陷。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种分子层析PCR检测方法，采用一种多层垂直流动型层析检测卡盒，该检测卡盒具有一体化的壳体构件，包括位于卡盒上部的第一壳体构件以及位于卡盒下部的第二壳体构件，所述第一壳体构件上设有加样窗，加样窗下设置检测试纸，该检测试纸由上至下包括：由过滤衬垫和第一过滤膜组成的缀合物垫、由加固垫和第二过滤膜层组成的结合物垫、一至若干层吸水垫；该检测试纸将加样区与检测区结合在一起，形成一种垂直流动型层析结构；该卡盒的第二壳体构件内具有一个受力支撑构件和一个与缀合物垫连接在一起的收缩构件，受力支撑构件挤压缀合物垫、结合物垫和吸水垫，使之与加样窗紧密贴合在一起；触动收缩构件，移开与收缩构件连接在一起的缀合物垫，使缀合物垫与结合物垫相互分离，使位于结合物垫上的检测区暴露于加样窗，从而使结果可视化；所述检测方法包括如下步骤：第一步，将待测样品进行PCR反应，得到PCR产物；第二步，将待测样品标记的PCR产物放置于所述检测卡盒的缀合物垫上，待测样品标记的PCR产物会将缀合物垫上的交联体溶解，通过第一过滤膜的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了抗体的结合物垫上，包被在结合物垫上检测线或点的抗体与样本中的待检片段及胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带；过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫上的质控线或点，与质控线或点上的Biotin-牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点若没有出现紫红色沉淀带，表示该检测是无效的；第三步，激活检测卡盒开关，查看结果。优选地，第一步中，所述待测样品在进行PCR反应之前，增加如下步骤：(1)待测样品在增菌培养基中36℃增菌培养18-24小时；(2)取上述增菌后液体，加入到含缓冲剂的EP管内，100℃煮沸10min；(3)EP管冷却至室温，取部分管内液体，加入到含反应试剂的PCR管中。优选地，第一步中，将PCR管放入热循环仪中，反应90min；取出PCR管，滴加4滴缓冲液。优选地，第二步中，将PCR管内所有液体加至所述检测卡盒中反应2min后，再滴加4滴缓冲液，反应1min。优选地，所述多层垂直流动型层析检测卡盒将传统的免疫胶体金侧向流水平层析优化成垂直流多层层析，去掉传统试纸条两端吸水垫的设置，将加样区和检测区有机的整合在一起，保证检测样液全部接触到检测区，从而提高了检测灵敏度。所述检测层析卡盒可以呈扁平状或立体的柱状。优选地，所述缀合物垫是由挠性或刚性过滤衬垫和第一过滤膜为贴合在一起的一体结构；所述检测卡的缀合物垫包括含有标记物的胶体金交联体或生物素或荧光素或地高辛抗体等的交联体，可以直接用来结合PCR产物或无损DNA或抗原以产生信号。所述结合物垫由加固垫和第二过滤膜为贴合在一起的一体结构，加固垫中间正对加样窗的部位开有导流窗口；第二过滤膜上位于正对导流窗口的部位包括含有检测信号的捕获剂或抗体的检测线或点和质控线或点，即构成了检测区。观察质控线或点上是否显色，从而可以判断该卡盒的检测是否有效。优选地，所述多层垂直流动型层析检测卡的试纸中设置两层过滤膜，所述吸水垫和加固垫通过第二过滤膜相互连接，所述过滤衬垫和加固垫通过第一过滤膜相连接。所述结合物垫的第二过滤膜上设有与加样窗边缘垂直相对的凹陷的环形导流槽，用于疏导液体向下流动，从而让样液集中在检测区域。优选地，所述检测试纸的检测区与所述加样窗位置相垂直对应，样液流动方向为从加样窗口向位于底层的吸水垫方向垂直流动；所述加样窗与所述缀合物垫密切接触，所述加样窗包括套环或O型环状窗框，缀合物垫不与第一壳体构件直接接触，而是在支撑受力构件的挤压下通过加样窗压紧缀合物垫，使周围不留一丝缝隙，这样也起到了屏蔽干扰和污染的作用。将样液滴加到加样窗，则待测样液中的PCR产物或无损DNA或抗原接触并渗透缀合物垫，到达结合物垫底层的第二过滤膜；多余的液体直接渗透到吸水垫或沿环形导流槽汇入吸水垫。这一过程中只有待测样液中的液体和它携带的PCR产物或抗体能够渗透缀合物垫和加固垫，其他杂质和空气中的分子无法通过缀合物垫。优选地，第三步中，所述激活检测卡盒开关具体为触动所述收缩构件；所述检测卡盒为机械触动设计，所述第一壳体构件上一端设有加样窗，另一端设有滑动槽或小孔；所述第二壳体构件内的收缩构件的开关从第一壳体构件的滑动槽伸出，拉动收缩构件的开关使收缩构件沿着滑动槽向另一端滑动，通过滑动收缩移开与收缩构件连接在一起的缀合物垫，使得缀合物垫与结合物垫相互分离，从而释放压力，收缩构件触动后，位于上层的缀合物垫收缩到滑动槽位置，位于下层的结合物垫上的检测区暴露在加样窗内，从而呈现出可视的反应结果；或者通过第一壳体构件上所设小孔以线绳或胶带或螺栓拉动或转动收缩构件移开缀合物垫，使位于结合物垫上的检测区暴露于加样窗，从而使结果可视化；检测结果读取不受外界污染和影响，整个检测卡盒一体成型，方便使用。所述收缩构件是向另一端水平拉动或水平转动或垂直按压的方式被拉松、转动或激活被移动、收缩或激活。优选地，所述受力支撑构件用于支撑吸水垫、结合物垫以及缀合物垫并施加向上的压力；受力支撑构件的受力面大小与加样窗大小一致，至少不小于加样窗的面积，受力支撑构件以活塞状的方式放置在第二壳体构件内；受力支撑构件采用柱状或蘑菇型或高脚杯型形状；受力支撑构件是单个整体或由多个部件组成。优选地，所述检测线或点和质控线或点设置于结合物垫的环形导流槽中间垂直正对加样窗的环岛上，构成了试纸的检测区。由于检测区位于加样区正下方，所以包被在环岛上的质控线或点和检测线或点上的捕获剂的量得以减少，从而在保证检测准确度的同时降低成本。优选地，所述第一壳体构件和第二壳体构件为一整体，所述第一壳体构件平行于第二壳体构件的边缘彼此相接紧密扣合在一起；或者第一壳体构件和第二壳体构件可通过弹簧、铰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分子层析PCR检测方法，其特征在于：采用一种多层垂直流动型层析检测卡盒，该检测卡盒具有一体化的壳体构件，包括位于卡盒上部的第一壳体构件(1)以及位于卡盒下部的第二壳体构件(2)，所述第一壳体构件(1)上设有加样窗(10)，加样窗(10)下设置检测试纸，该检测试纸由上至下包括：由过滤衬垫(3)和第一过滤膜(4)组成的缀合物垫(15)、由加固垫(5)和第二过滤膜层(11)组成的结合物垫(16)、一至若干层吸水垫；该检测试纸将加样区与检测区结合在一起，形成一种垂直流动型层析结构；该卡盒的第二壳体构件(2)内具有一个受力支撑构件(8)和一个与缀合物垫(15)连接在一起的收缩构件(9)，受力支撑构件(8)挤压缀合物垫(15)、结合物垫(16)和吸水垫，使之与加样窗(10)紧密贴合在一起；触动收缩构件(9)，移开与收缩构件(9)连接在一起的缀合物垫(15)，使缀合物垫(15)与结合物垫(16)相互分离，使位于结合物垫(16)上的检测区暴露于加样窗(10)，从而使结果可视化；所述检测方法包括如下步骤：第一步，将待测样品进行PCR反应，得到PCR产物；第二步，将待测样品标记的PCR产物放置于所述检测卡盒的缀合物垫(15)上，待测样品标记的PCR产物会将缀合物垫(15)上的交联体溶解，通过第一过滤膜(4)的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了抗体的结合物垫(16)上，包被在结合物垫(16)上检测线或点(52)的抗体与样本中的待检片段及胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带；过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫(16)上的质控线或点(51)，与质控线或点(51)上的Biotin‑牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点(51)若没有出现紫红色沉淀带，表示该检测是无效的；第三步，激活检测卡盒开关，查看结果。...

【技术特征摘要】
1.一种分子层析PCR检测方法，其特征在于：采用一种多层垂直流动型层析检测卡盒，该检测卡盒具有一体化的壳体构件，包括位于卡盒上部的第一壳体构件(1)以及位于卡盒下部的第二壳体构件(2)，所述第一壳体构件(1)上设有加样窗(10)，加样窗(10)下设置检测试纸，该检测试纸由上至下包括：由过滤衬垫(3)和第一过滤膜(4)组成的缀合物垫(15)、由加固垫(5)和第二过滤膜层(11)组成的结合物垫(16)、一至若干层吸水垫；该检测试纸将加样区与检测区结合在一起，形成一种垂直流动型层析结构；该卡盒的第二壳体构件(2)内具有一个受力支撑构件(8)和一个与缀合物垫(15)连接在一起的收缩构件(9)，受力支撑构件(8)挤压缀合物垫(15)、结合物垫(16)和吸水垫，使之与加样窗(10)紧密贴合在一起；触动收缩构件(9)，移开与收缩构件(9)连接在一起的缀合物垫(15)，使缀合物垫(15)与结合物垫(16)相互分离，使位于结合物垫(16)上的检测区暴露于加样窗(10)，从而使结果可视化；所述检测方法包括如下步骤：第一步，将待测样品进行PCR反应，得到PCR产物；第二步，将待测样品标记的PCR产物放置于所述检测卡盒的缀合物垫(15)上，待测样品标记的PCR产物会将缀合物垫(15)上的交联体溶解，通过第一过滤膜(4)的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了抗体的结合物垫(16)上，包被在结合物垫(16)上检测线或点(52)的抗体与样本中的待检片段及胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带；过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫(16)上的质控线或点(51)，与质控线或点(51)上的Biotin-牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点(51)若没有出现紫红色沉淀带，表示该检测是无效的；第三步，激活检测卡盒开关，查看结果。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：第一步中，所述待测样品在进行PCR反应之前，增加如下步骤：(1)待测样品在增菌培养基中36℃增菌培养18-24小时；(2)取上述增菌后液体，加入到含缓冲剂的EP管内，100℃煮沸10min；(3)EP管冷却至室温，取部分管内液体，加入到含反应试剂的PCR管中。3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：第一步中，将PCR管放入热循环仪中，反应90min；取出PCR管，滴加4滴缓冲液。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：第二步中，将PCR管内所有液体加至所述检测卡盒中反应2min后，再滴加4滴缓冲液，反应1min。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述吸水垫和加固垫(5)通过第二过滤膜(11)相互连接，所述过滤衬垫(3)和加固垫(5)通过第一过滤膜(4)相连接；所述结合物垫(16)的第二过滤膜(11)上设有与加样窗(10)边缘垂直相对的凹陷的环形导流槽(14)，用于让样液集中在检测区域。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测试纸的检测区与所述加样窗(10)位置垂直对应，样液流动方向为从加样窗(10)向位于试纸底层的吸水垫方向垂直流动；所述加样窗(10)与所述缀合物垫(15)接触，所述加样窗(10)包括套环或O型环状窗框，使缀合物垫(15)不与第一壳体构件(1)直接接触，而是通过加样窗(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩峰，雷杰，
申请(专利权)人：上海美凯纯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31