一种新型细胞提取液的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种新型细胞提取液的制备方法，具体地，本发明专利技术首次意外地发现了一种能够大规模、高效率、低成本的制备细胞提取物的方法。本发明专利技术通过对冷激处理过的细胞原料（优选酵母细胞原料）进行低温液氮机械破碎处理，并对所获得的细胞提取物进行体外活性检测（优选体外蛋白生物合成的活性检测），结果表明，用本发明专利技术的制备方法所获得的细胞提取物具有非常高的体外蛋白合成能力。

【技术实现步骤摘要】
一种新型细胞提取液的制备方法
本专利技术涉及细胞提取领域，具体地，涉及一种新型细胞提取液的制备方法。
技术介绍
传统的蛋白表达系统是指通过模式生物细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等表达外源基因的一种分子生物学技术。随着科学技术的发展，无细胞表达体系也称为体外蛋白合成系统应运而生，其是以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的合成。体外翻译系统中表达蛋白质无需进行质粒构建，转化，细胞培养，细胞收集和破碎步骤，是一种快速的，省时省力的蛋白质表达系统。现有体外蛋白表达系统的细胞制备方法在很多方面还存在技术上的缺陷与不足：1.细胞预处理过于简单，现有方法仅仅停留在简单的洗细胞操作，未对为对清洗细胞以及这一步的关键点有充分优化和阐释说明；另外，现有方法也没有专门涉及“冷激”、“温度控制”或其他可以增强体外翻译活性的处理步骤。2.制备过程繁琐。3.破碎步骤实用的仪器效率低，无法很难实现大规模制备。4.高压均质器破碎法，仪器设备的投入和维护的费用较高（10万–100万元／台），通量小（50-500mL），要求稀释细胞浓度（100-300g/L），进而增加了后续处理工艺难度，并需要增加脱盐、浓缩等步骤，才能获得适当的反应活性。5.含细胞壁的细胞制备时，现有方法需要较剧烈的条件破碎细胞（如高压均质器在较高的压力下破碎）或者用酶解法如破碎烟草BY-2时用罗氏的液体细胞壁裂解酶对细胞进行处理，无法对温度进行有效的控制，制备工序繁琐且耗时长；6.最后，现有方法中对制备细胞提取物的制备细节、温度偏差、处理时间、方式等均未有详尽的研究和发展。以上的缺陷与不足造成现有的制备方法产量低，成本高，进一步造成相关的体外合成系统成本较高、目前仅限于极少数实验室内使用，严重的制约了体外蛋白制造的商业应用和工业化产业拓展。因此，本领域迫切需要开发一种能够大规模、高效率、低成本的制备细胞提取物的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种能够大规模、高效率、低成本的制备细胞提取物的方法。本专利技术第一方面提供了一种细胞提取物的制备方法，包括步骤：(i)提供一细胞原料；(ii)将所述细胞原料经低温液氮机械破碎处理，获得细胞粉；(iii)将步骤(ii)获得的细胞粉经低温溶解、离心，从而获得所述的细胞提取物。在另一优选例中，步骤(i)中所述的细胞原料为经冷激处理的细胞原料。在另一优选例中，所述冷激处理的温度为0－115℃，较佳地，0－10℃，更佳地，2－8℃。在另一优选例中，所述冷激处理时间为5min－12h，较佳地，10min－6h，更佳地，20min－1h。在另一优选例中，所述细胞原料为细胞泥。在另一优选例中，所述细胞原料为酵母细胞原料。在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组的一种或多种来源的酵母：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克鲁维酵母，更佳地为乳酸克鲁维酵母。在另一优选例中，所述细胞原料由以下方法制得：(a1)将细胞单菌落接种于培养基中进行培养，从而获得种子液；(a2)将步骤(a1)获得的种子液接种到培养基中进行培养，离心获得细胞；(a3)用低温洗涤液重悬所述细胞，冷激处理后获得所述的细胞原料。在另一优选例中，所述步骤(a1)的培养基包括YPD培养基。在另一优选例中，所述步骤(a2)的培养基包括YPD培养基。在另一优选例中，所述步骤(a2)的培养基中含有磷酸根离子。在另一优选例中，所述磷酸根离子的含量为5-100mM，较佳地，10-80mM，更佳地，20－70mM。在另一优选例中，所述步骤(a2)还包括在细胞生长对数期的中后期（14-16h）离心获得细胞的步骤。在另一优选例中，步骤(a3)中，所述低温为0-10℃，较佳地，1-8℃，更佳地，2-6℃。在另一优选例中，所述洗涤液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾(HEPES),醋酸钾（KOAc）、醋酸镁（MgOAc）、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、或其组合。在另一优选例中，所述洗涤液中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾(HEPES)的浓度为5-100mM，较佳地，8-80mM，更佳地，9-60mM。在另一优选例中，所述洗涤液中，醋酸钾的浓度为5-500mM，较佳地，10-300mM，更佳地，20-200mM。在另一优选例中，所述洗涤液中，醋酸镁的浓度为0.1-40mM，较佳地，0.5-30mM，更佳地，0.8-10mM。在另一优选例中，所述洗涤液的pH为6-9，较佳地，7-9。在另一优选例中，所述步骤(i)和步骤(ii)之间还包括步骤(i’)：用低温洗涤液重悬所述细胞原料，离心、清洗后，经液氮速冻，低温保存。在另一优选例中，所述步骤(i’)中，所述低温为0-10℃，较佳地，1-8℃，更佳地，2-6℃。在另一优选例中，所述步骤(i’)中，在-196－0℃，较佳地，-196－-20℃，更佳地，-100℃－-50℃的温度下进行低温保存。在另一优选例中，所述步骤(ii)中，用液氮低温搅拌破碎机（LNCryo-Blender）或液氮低温粉碎机（LNCryo-Grinder）破碎细胞。在另一优选例中，步骤(ii)中，破碎时间为1-30min，较佳地，2-20min，更佳地，3-10min。在另一优选例中，步骤(ii)中，破碎细胞所用的转速为3000－45000rpm，较佳地，10000－40000rpm，更佳地，20000－30000rpm。在另一优选例中，步骤(ii)中，破碎细胞时所用的筛网为80-1000目。在另一优选例中，所述步骤(iii)中，用低温缓冲液溶解细胞粉5min－12h，较佳地，8min－6h，更佳地，10min－2h，更佳地，30min-2h。在另一优选例中，所述步骤(iii)中，用低温缓冲液溶解细胞粉5-50min，较佳地，8-40min，更佳地，10-30min。在另一优选例中，所述缓冲液包括裂解液。在另一优选例中，所述裂解液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾（HEPES-K）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-Na）、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇（DTT）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、或其组合。在另一优选例中，所述缓冲液的pH为6-9，较佳地，7-9。在另一优选例中，所述细胞粉与缓冲液的比例为1g:0.02-20mL，较佳地，1g：0.08-10mL，更佳地，1g：0.1-5mL。在另一优选例中，所述缓冲液中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾（HEPES-K）的浓度为5-100mM，较佳地，8-80mM，更佳地，9-60mM。在另一优选例中，所述缓冲液中，三羟甲基氨基甲烷（Tris-Na）的浓度为1-200mM，较佳地，5-80mM，更佳地，8-60mM。在另一优选例中，所述缓冲液中，醋酸钾的浓度为5-300mM，较佳地，10-250mM，更佳地，30-200m。在另一优选例中，所述缓冲液中，醋酸镁的浓度为0.1-40mM，较佳地，0.5-20mM，更佳地，0.8-10mM。在另一优选例中，所述缓冲液中，二硫苏糖醇（DTT）的浓度为0.2-50mM，较佳地，0.5-20mM，更佳地，0.8-10mM。在另一优选例中，所述缓冲液中，苯甲基磺酰氟（PMSF）的浓度为0.05-20mM，较佳地，0.1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括步骤：(i) 提供一细胞原料；(ii) 将所述细胞原料经低温液氮机械破碎处理，获得细胞粉；(iii) 将步骤(ii)获得的细胞粉经低温溶解、离心，从而获得所述的细胞提取物。

【技术特征摘要】
1.一种细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供一细胞原料；(ii)将所述细胞原料经低温液氮机械破碎处理，获得细胞粉；(iii)将步骤(ii)获得的细胞粉经低温溶解、离心，从而获得所述的细胞提取物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)中所述的细胞原料为经冷激处理的细胞原料。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冷激处理的温度0－115℃，较佳地，0－10℃，更佳地，2－8℃。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冷激处理时间为5min－12h，较佳地，10min－6h，更佳地，20min－1h。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞原料为酵母细胞原料。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞选自下组的一种或多种...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，刘帅龙，柴智，王海鹏，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31