脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，其采用机械刺激和低氧刺激的条件培养脐带间充质干细胞，促进干细胞因子分泌，同时采用脱脂乳粉、海藻糖、羧甲基纤维素、羟乙基淀粉、谷氨酰胺和泊洛沙姆各组分的合理配合作为冻干粉保护剂，制备得到的期待间充质干细胞因子冻干粉具有良好的稳定性、干细胞因子含量及活性。

【技术实现步骤摘要】
脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法。
技术介绍
干细胞在稳定生长过程中，会分泌许多种细胞因子，以蛋白质多肽形式分泌到培养基上清中，通过收集处理培养干细胞之后的上清液，通过一系列处理，可以获得大量细胞因子，这些人源性因子包括EGF(表皮生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、HGF(肝脏生长因子)、PDGF(血小板衍生因子)、bFGF(成纤维细胞生长因子)等。这些因子大都具有与皮肤生长、血管生长、皮下组织再生有关的生物活性，能够有效调控机体细胞信号传导，活化人体细胞进而生理性修复或替代机体损伤、衰老细胞，促进改善皮肤再生修复。液体状态下的干细胞生物活性肽溶液在室温保存时间短，不利于运输，浓度也低。并且异体来源的干细胞生物活性肽，干细胞种子虽然经过筛选，但仍然存在微生物感染风险。还有一些产品是通过直接裂解干细胞或其它活性细胞直接获得，蛋白成分复杂，虽然浓度高，但无效蛋白多，对人体也将是代谢压力。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，提高干细胞因子的产量、生物活性和稳定性，快速制备得浓度高、无微生物感染风险、可长期保持活性的脐带间充质干细胞因子。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括以下步骤：(1)取脐带上的华通氏胶，离体培养得脐带间充质干细胞，记为P0代；(2)传代3～5次，即至P3～P5代后，置于低氧环境中培养4～8h，并对细胞进行机械牵拉；(3)恢复正常氧气浓度，继续培养；(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脐带间充质干细胞因子。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述的置于低氧环境中培养为：于(5±0.5)％CO2和(5±0.5)O2的条件下培养。在其中一些实施例中，所述对细胞进行机械牵拉的方法为：传代时将细胞转移至机械牵拉细胞培养盒中，细胞贴壁附着于机械牵拉细胞培养盒的弹性膜上生长；所述机械牵拉包括：一次将弹性膜拉长15％～30％。在其中一些实施例中，步骤(1)所述的离体培养得脐带间充质干细胞，包括以下步骤：取脐带上的华通氏胶，置于培养皿中至贴壁后，加入培养基，于二氧化碳培养箱中培养；2～3日后，将其中一半的培养基更换为新鲜的培养基，继续培养4～5日，华通氏胶的组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，更换新的培养基继续培养，至细胞融合度达到80％～90％时，弃去组织块，即得。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的超滤透析为：通过30～50KD的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过90～110D超滤膜，收集截流液。本专利技术还提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，具体技术方案如下：一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如上所述制备得到的脐带间充质干细胞因子的浓缩液，加入冻干保护剂，冻干，即得。在其中一些实施例中，所述冻干保护剂为：每100mL所述脐带间充质干细胞因子的浓缩液中，加入以下组分：5～20g脱脂乳粉、1～15g海藻糖、2～10g羧甲基纤维素、1～5g羟乙基淀粉、0.01～0.1g谷氨酰胺、1～5g泊洛沙姆。在其中一些实施例中，所述冻干的条件为：以9～11℃/min的速度降至-60～-45℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强10～50Pa，温度-38～35℃的条件下冻干20～48h。本专利技术还提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉，具体技术方案如下：一种脐带间充质干细胞因子冻干粉，由如上所述的制备方法制备得到。本专利技术还提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的应用，具体技术方案如下：脐带间充质干细胞因子冻干粉在制备促进伤口愈合的药物或医用材料中的应用。基于上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的专利技术人在培养干细胞中发现，低氧刺激和机械刺激在脐带间充质干细胞的培养中，可提升细胞因子的分泌能力，本专利技术通过将脐带上的华通氏胶离体培养得到的脐带间充质干细胞在低氧和机械刺激的环境下培养，制备得到脐带间充质干细胞因子。其中，选用脐带间充质干细胞避开了社会伦理争议，增殖较快、免疫排斥低，而且该干细胞因子的制备方法制备得到的细胞因子的含量高、促进伤口愈合的活性好。进一步地，本专利技术采用上述方法培养脐带间充质干细胞制备得到的干细胞因子与合适的冻干粉保护剂制备得到脐带间充质干细胞因子冻干粉，其有利于干细胞因子的长期稳定保存。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照实施例对本专利技术进行更全面的描述，以下给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术提供了一种脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括以下步骤：(1)取脐带上的华通氏胶，离体培养得脐带间充质干细胞，记为P0代；(2)传代3～5次，即至P3～P5代后，置于低氧环境中培养4～8h，并对细胞进行机械牵拉；(3)恢复正常氧气浓度，于二氧化碳培养箱中继续培养；(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脐带间充质干细胞因子。具体地，取脐带上的华通氏胶，离体培养得脐带间充质干细胞的方法为：取脐带上的华通氏胶，置于培养皿中至贴壁后，加入培养基，于二氧化碳培养箱中培养；2～3日后，将其中一半的培养基更换为新鲜的培养基，继续培养4～5日，华通氏胶的组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，更换新的培养基继续培养，至细胞融合度达到80％～90％时，弃去组织块，即得。优选地，脐带间上的华通氏胶按照以下步骤获取得到：1)在超净台中取出运输液中的脐带，放于培养皿中，用清洗液洗涤数遍已去除脐带表面的血液；2)将清洗后的脐带，剪成2-3cm长的小段于培养皿，用清洗液逐个洗涤数遍，已去除残留在里面的血液；3)每一段再经无抗生素的0.9％的无菌生理盐水清洗数遍，将羊膜动静脉管剥离，只保留华通氏胶体。优选地，将华通氏胶体置于培养皿中培养的步骤包括：将所有的华通氏胶体移至离心管中，加入1-2倍的生理盐水，用剪刀将其剪碎，800～1000g，离心3～8min；5)弃去上清，将组织沉淀平均分于60cm2的培养皿中，待其贴壁加入8～10mL脐带间充质干细胞培养基，放于(37±5)℃，(5±0.5)％二氧化碳培养箱培养。其中，优选的脐带间充质干细胞培养基为：LONZA12-725F。优选地，离体培养的步骤包括：1)当培养上述脐带华通氏胶组织块2～3天，对其进行半换液处理即加入4～6mL新鲜培养基；2)培养4～6天，组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，可记为P0代，进行全换液处理；3)培养5～6d，间充质干细胞融合度达到80～90％，弃去脐带组织块和原有培养液，生理盐水洗涤一次；4)加入2～3mL0.25％胰酶，放于培养箱中消化20～30s，加入盐水进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取脐带上的华通氏胶，离体培养得脐带间充质干细胞，记为P0代；(2)传代3～5次，即至P3～P5代后，置于低氧环境中培养4～8h，并对细胞进行机械牵拉；(3)恢复正常氧气浓度，继续培养；(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脐带间充质干细胞因子。

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取脐带上的华通氏胶，离体培养得脐带间充质干细胞，记为P0代；(2)传代3～5次，即至P3～P5代后，置于低氧环境中培养4～8h，并对细胞进行机械牵拉；(3)恢复正常氧气浓度，继续培养；(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脐带间充质干细胞因子。2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的置于低氧环境中培养为：于(5±0.5)％CO2和(5±0.5)O2的条件下培养。3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，所述对细胞进行机械牵拉的方法为：传代时将细胞转移至机械牵拉细胞培养盒中，细胞贴壁附着于机械牵拉细胞培养盒的弹性膜上生长；所述机械牵拉包括：一次将弹性膜拉长15％～30％。4.根据权利要求1～3任一项所述的脐带间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的离体培养得脐带间充质干细胞，包括以下步骤：取脐带上的华通氏胶，置于培养皿中至贴壁后，加入培养基，于二氧化碳培养箱中培养；2～3日后，将其中一半的培养基更换为新鲜的培养基，继续培养4～5日，华通氏胶的组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，更换新的培养基继续培养，至细胞融合度达到80％～90％时...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕飞，车七石，刘少辉，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44