S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法技术

本发明专利技术属于油菜分子育种技术领域，公开了一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法，F1种子的获得、自交系S单倍型的检测、自交不亲和两系和三系杂种种子的获得、利用得到的两系杂种和三系杂种种子，布置品种筛选试验。本发明专利技术通过利用双重PCR标记鉴定F1的S单倍型，克服了实验过程偶然因素导致不产生标记的技术缺陷，从而能准确判断自交系的S单倍型及其恢复或保持性；分子标记技术克服了油菜自交不亲和杂种选育过程中育性鉴定的繁琐性和组合配置的盲目性，大大地减少育种工作量，缩短育种周期，提高育种效率，促进快速培育甘蓝型油菜自交不亲和杂交种。

【技术实现步骤摘要】
S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法
本专利技术属于油菜分子育种
，尤其涉及一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：自交不亲和(Self-incompatibility，SI)是植物界普遍存在的、雌雄蕊发育正常但自交或兄妹交结籽很少甚至不结籽的自然现象，是植物杂种优势利用的一条重要途径。天然的白菜和甘蓝为自交不亲和，自交不亲和性一直被广泛应用于选育白菜和甘蓝的杂交种，杂交种的种植很显著地提高了白菜和甘蓝的产量。甘蓝型油菜(或称油菜)(AACC，2n＝38)由白菜(AA，2n＝20)和甘蓝(CC，2n＝18)自然杂交、加倍而成，但自交亲和(Self-compatibility，SC)。傅廷栋等通过甘蓝型油菜与白菜种间杂交，育成甘蓝型油菜自交不亲和系“271”等。“271”与自交亲和系杂交得到F1，有的F1依然为SI、有的F1为SC，由此，提出自交不亲和“三系”(自交不亲和系、保持系、恢复系)杂种选育方法(傅廷栋主编，1995)。申请人研制出一种大量繁殖自交不亲和系的方法(专利号：ZL200810236719.X)，创建了油菜自交不亲和“两系”(自交不亲和系、恢复系)杂种选育方法(专利号：ZL200810236960.2)。自交不亲和“三系”和“两系”杂种与当前被最广泛应用的细胞质雄性不育杂种相比，具有无细胞质负效应、恢复源广因而易选育到强优势杂交种、杂种制种产量高等优点。油菜自交不亲和“三系”和“两系”杂种选育的重要环节是配置组合、鉴定组合育性和筛选组合。通常的做法是，首先自交不亲和系(母本)与自交系(父本)杂交，得到少量F1种子；然后，种植F1种子，在开花期对F1植株进行套袋自交，成熟期调查角果的籽粒数，依据F1植株平均每个角果的结籽情况判断父本为恢复系或保持系；再在隔离条件下种植母本与恢复系，配置较多的F1种子；最后，布置F1杂种筛选试验。因而，这种方法的缺点显而易见，一是费时：一个周期至少需花四个年份；二是费事：鉴别F1植株亲和性步骤繁琐(见文献，李春艳等，甘蓝型油菜自交不亲和临保性及其连锁AFLP标记，作物学报，2007，33：1452-1457)；三是效率低：前期组合配置针对性不强。油菜作为我国最主要的油料作物，只有当杂种为可育(自交亲和)时，才能在生产上推广，否则，杂种不育将导致严重减产甚至绝收的危害。油菜雄性不育由于雄蕊退化、没有花粉，用肉眼就很容易从外观准确判断；自交不亲和花器官发育正常，只能通过自交结籽情况进行判断，不仅费时、而且效率低下，还受时间限制(必须在油菜开花后进行)和环境影响(倒春寒等异常天气也会引起植株不正常结籽)。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术根据F1植株的结籽情况判断自交系恢复保持性然后在配置组合、进行杂种筛选试验，育种周期长；现有技术不能克服油菜自交不亲和杂种选育过程中组合配置的盲目性，造成育种工作量大，不易育成优良杂交种。现有技术不能克服F1植株的结籽性会受到异常天气和植株自身生理状况的影响，从而导致对自交系恢复保持性的误判。现有技术中，自交结籽情况进行判断时，费时、而且效率低下，还受时间限制(必须在油菜开花后进行)和环境影响(倒春寒等异常天气也会引起植株不正常结籽)。现有技术没有克服单标记检测F1的S单倍型或者双重PCR分子标记直接检测自交系实验过程偶然因素导致不产生标记的技术缺陷。现有技术不能同时配置两系和三系杂种，组合配置效率低。解决上述技术问题的难度和意义：我国最早选育的油菜杂交种是自交不亲和杂交种，但是没有得到推广，其中主要原因之一就是亲和/不亲和表型鉴别困难，导致了育种周期长、组合配置盲目因而难以得到优势杂交种、育种工作量。自交不亲和植株的花器官发育正常，只能通过自交、成熟时的角果结籽情况进行判断，不仅费时、而且效率低下，还受时间限制(必须在油菜开花后进行)和环境影响(倒春寒等异常天气也会引起植株不正常结籽)。花粉管荧光显微观察法(KhoYO,J.Observingpollentubesbymeansoffluorescence.Euphytica,1968,17:298-302.)，利用油菜等植株孢子体自交不亲和花粉管不萌发、或者萌发但不伸长的细胞学特点，通过观察授粉后花粉管的生长状况作出判断。该方法在开花期就可以鉴别植株亲和性，但是应用于大田育种有困难：一是不能准确判断亲和/不亲和性，有的植株在早花期花粉管不伸长、表现为强自交不亲和，晚花期自交不亲和性消失、自交仍能正常结籽；二是，需要在开花期进行，可检测时间极其短暂，因而没法鉴定大量植株的表型。本专利技术尝试了利用分子标记技术鉴别植株亲和/不亲和性，但是没有克服实验过程偶然因素导致不产生标记的技术缺陷。因而本专利技术创造性提出利用S单倍型双重PCR分子标记鉴定自交系恢复保持性，组合配置了具有针对性、快速选育甘蓝型油菜自交不亲和杂种的方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法。本专利技术发现甘蓝型油菜自交不亲和系、保持系和恢复系C基因组具有共同的S单倍型BnS-6，A基因组的S单倍型分别为BnS-1300、BnS-7和BnS-1，创建了甘蓝型油菜S单倍型的分子检测技术(专利号：ZL201310366045.6)，包括4个SCAR分子标记：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2，以及对这4个SCAR分子标记进行组合得到的2对双重PCR标记：SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300。SRK1-1+SRK-1300检测BnS-1和BnS-1300，SCR7-2+SRK-1300检测BnS-7和BnS-1300。利用S单倍型双重PCR分子标记鉴定自交系恢复保持性，以便组合配置具有针对性、快速选育甘蓝型油菜自交不亲和杂交种的方法，迄今为止还没有报道。本专利技术通过双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测自交不亲和系与自交系杂交所得F1的S单倍型，鉴别自交系的恢复性和保持性，通过以自交不亲和系和SI×保持系F1为母本、恢复系为父本，在人工或自然隔离区配置“三系”杂种和“两系”杂种，通过杂种筛选试验得到新的油菜自交不亲和“三系”杂种和“两系”杂种。本专利技术是这样实现的，一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法，所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法包括：步骤一，F1种子的获得：以油菜自交不亲和系和自交亲和系为亲本，进行正交和/或反交，得到F1种子；步骤二，自交系S单倍型的检测：在培养皿上播种自交不亲和系、自交亲和系和F1种子，利用双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测F1的S单倍型、判断自交亲和系的恢复性和保持性；若在F1中，SRK1-1+SRK-1300引物组合产生2条、SCR7-2+SRK-1300引物组合产生1条扩增产物，则自交系具有S单倍型为BnS-1BnS-1，为恢复系；若SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300引物组合分别在F1中出现1个和2个标记，则自交系的S单倍型为BnS-7Bn本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法，其特征在于，所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法包括：步骤一，F1种子的获得：以油菜自交不亲和系和自交亲和系为亲本，进行正交和/或反交，得到F1种子；步骤二，自交系S单倍型的检测：在培养皿上播种自交不亲和系、自交亲和系和F1种子，利用双重PCR标记SRK1‑1+SRK‑1300和SCR7‑2+SRK‑1300检测F1的S单倍型、判断自交亲和系的恢复性和保持性；若在F1中，SRK1‑1+SRK‑1300引物组合产生2条、SCR7‑2+SRK‑1300引物组合产生1条扩增产物，则自交系具有S位点单倍型BnS‑1BnS‑1，为恢复系；若SRK1‑1+SRK‑1300和SCR7‑2+SRK‑1300引物组合分别在F1中出现1个和2个标记，则自交系的S位点单倍型为BnS‑7BnS‑7，为保持系；若SRK1‑1+SRK‑1300和SCR7‑2+SRK‑1300引物组合在F1中都出现2个标记，则自交系的S位点单倍型为杂合、为BnS‑7BnS‑1；若SRK1‑1+SRK‑1300和/或SCR7‑2+SRK‑1300引物组合在F1中没有扩增产物，不确定因素使实验失败；步骤三，自交不亲和两系和三系杂种种子的获得：在人工或自然隔离区种植油菜若干自交不亲和系、步骤一的若干F1和步骤一的恢复系，其中，自交不亲和系和SI×保持系F1作为母本，恢复系作为父本，母本与父本行比为2:1～6:1；成熟期，分别收获自交不亲和系和SI×保持系F1植株的种子，得到两系杂种和三系杂种种子，自交不亲和系植株的种子是两系杂种种子，SI×保持系F1植株的种子是三系杂种种子；步骤四，利用步骤三得到的两系杂种和三系杂种种子，布置品种筛选试验。...

【技术特征摘要】
1.一种S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法，其特征在于，所述S单倍型分子标记辅助选育油菜自交不亲和杂交种的方法包括：步骤一，F1种子的获得：以油菜自交不亲和系和自交亲和系为亲本，进行正交和/或反交，得到F1种子；步骤二，自交系S单倍型的检测：在培养皿上播种自交不亲和系、自交亲和系和F1种子，利用双重PCR标记SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300检测F1的S单倍型、判断自交亲和系的恢复性和保持性；若在F1中，SRK1-1+SRK-1300引物组合产生2条、SCR7-2+SRK-1300引物组合产生1条扩增产物，则自交系具有S位点单倍型BnS-1BnS-1，为恢复系；若SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300引物组合分别在F1中出现1个和2个标记，则自交系的S位点单倍型为BnS-7BnS-7，为保持系；若SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300引物组合在F1中都出现2个标记，则自交系的S位点单倍型为杂合、为BnS-7BnS-1；若SRK1-1+SRK-1300和/或SCR7-2+SRK-1300引物组合在F1中没有扩增产物，不确定因...

【专利技术属性】
技术研发人员：马朝芝，易斌，文静，傅廷栋，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42