一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法技术

本发明专利技术公开了一种成本低、周期短、重复性好、操作简单、转化效率高的同步获得乌菜雄性不育系与保持系转基因植株的方法。其特征包括以下步骤：(1)盛花期去除不育系与保持系植株已开放的花，用纸袋套住花序并密封。(2)剥除保持系3～5mm大小花蕾的萼片与花瓣。(3)侵染液悬浮农杆菌菌体至OD600＝0.2。(4)侵染液滴至保持系花药上并暗处理2天。(5)采用授粉工具对保持系与不育系花朵柱头进行人工授粉。(6)重复上述操作3次。(7)分别采收不育系和保持系种子。(8)采收的种子进行Kan抗性及GUS染色鉴定，即可获得转基因植株。本方法直接在大田操作，不需要通过组织培养，即可获得转基因乌菜雄性不育系植株。

A Rapid and Synchronized Method for Obtaining Transgenic Plants of Male Sterility and Maintenance Line of Urumqi Cabbage

The invention discloses a method for synchronously obtaining transgenic plants of the male sterile line and the maintainer line of Chinese cabbage with low cost, short cycle, good repeatability, simple operation and high transformation efficiency. Its characteristics include the following steps: (1) removing blooming flowers from sterile and maintainer plants at full flowering stage, wrapping inflorescences in paper bags and sealing them. (2) The sepals and petals of the 3-5mm buds of the maintainer line were stripped. (3) Suspension of Agrobacterium tumefaciens in the infection solution to OD600=0.2. (4) The infected droplets reached the maintainer anther and were treated dark for 2 days. (5) Artificial pollination of stigmas of maintainer and sterile lines was carried out by means of pollination tools. (6) Repeat the operation three times. (7) The seeds of male sterile line and maintainer line were harvested respectively. (8) Transgenic plants can be obtained from harvested seeds by Kan resistance and GUS staining. The method is directly operated in the field, and the transgenic male sterile lines of Chinese cabbage can be obtained without tissue culture.

【技术实现步骤摘要】
一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法
本专利技术属于植物基因工程领域，特别提供了一种成本低、周期短、重复性好、操作简单、效率高的同步获得乌菜雄性不育系与保持系转基因植株的方法。
技术介绍
乌菜，原产我国，为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是江淮地区种植面积最大的蔬菜之一。长期以来，乌菜品种改良主要通过品种杂交、远缘杂交等，存在育种年限长、成本高、亲本自交多代易退化、雄性不育转育困难等诸多弊端，并且至今尚无成熟的再生系统。目前，农杆菌介导法、基因枪法、超声波辅助转化法等等均需要再生体系；注射法需要较大的花器；花粉管通道法需要对柱头进行切口，且转化效率很低，这些遗传转化技术限制了乌菜基因工程的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法，以解决现有技术中乌菜改良品种成本高、操作复杂等问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法，该方法包括以下步骤：步骤1、在乌菜盛花期，去除雄性不育系与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系主花序3～5mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药；步骤2、将含有植物表达载体的农杆菌培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2；步骤3、利用注射器等工具将侵染液滴至花药上，静置30min后，避光处理2天；步骤4、2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉；步骤5、授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止蜜蜂、昆虫等进入；步骤6、在同一花序上对长至3～5mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；步骤7、一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系的种子；步骤8、将收获的种子播种于含有Kan的筛选培养基上，筛选萌发正常、子叶与真叶为绿色的幼苗，取其部分叶片进行GUS染色，GUS染色呈蓝色的即为转基因阳性植株。进一步，所述步骤2中侵染液各成分为每升MS中加入蔗糖50g、Silwet300μL、MES0.5g、乙酰丁香酮0.2mg和L-半胱氨酸0.12g，pH为5.8。进一步，所述步骤8中筛选培养基由MS、蔗糖、Kan和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、Kan500mg、琼脂15mg，pH为5.8。进一步，将步骤4替换为2天后，花蕾开放，利用干净毛笔，轻轻蘸取保持系花药上的花粉，对雄性不育系及保持系花的柱头进行辅助授粉。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术以大田栽植的乌菜花蕾为侵染对象，较传统采用组织培养进行遗传转化，该方法无需无菌苗及外植体，不经过组织再生即可获得转基因植株，取材方便，方法简便，节约时间。(2)本专利技术利用农杆菌侵染未开放花蕾的花药，一个花蕾的花药数量巨大，只需侵染少量花蕾，便可为多个柱头进行授粉，该方法操作简单、工作量小。(3)本专利技术将侵染的花药授予雄性不育系与保持系花的柱头上，可获得大量的种子，且遗传转化具有针对性，转化效率高。(4)本专利技术利用侵染液，将农杆菌悬浮，室温静置30min后，再侵染花药，该侵染液成分可提高瞬时表达率，为高转化效率奠定了基础。(5)本专利技术以侵染未开放花蕾的花药，再进行人工授粉，获得转基因植株，该方法相较现有的农杆菌介导外植体、基因枪、花粉管通道法、花序浸染法等遗传转化方法，农杆菌侵染的花药，与卵细胞完成受精作用，再发育成种子，可避免因组织培养而产生的嵌合体等问题。(6)本专利技术将侵染雄性不育保持系花的花粉，授予保持系与雄性不育系植株的柱头上，可同时获得保持系与不育系的转基因植株，不需要先获得保持系转基因植株，再经过杂交等方法，将目的基因转移至雄性不育系植株中，该方法可缩短2～3年的育种时间(杂交选育最少需要2～3年)。说明书附图图1为乌菜雄性不育系花(花药败育，无花粉)。图2为乌菜保持系3～5mm大小的花蕾及完全开放的花。图3为转基因植株部分叶片(右)与未转基因植株部分叶片(左)的GUS染色结果。图4为乌菜保持系花药农杆菌侵染前(右)与侵染后(左)的GUS染色结果。图5为花蕾不同处理方式的GUS染色结果。图6为不同侵染方式的GUS染色结果。图7为转基因种子(右)与未转基因种子(左)的GUS染色结果。图8为乌菜保持系与不育系采用其他方法获得荚果，右侧雄性不育系未获得种子。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出的详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：1)在乌菜盛花期，去除雄性不育系(图1，花药上无花粉)与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系3～5mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药(图2)；2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2，室温静置30min后备用；3)利用注射器等工具将侵染液滴至花药上，静置30min后，避光处理2天；4)2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉，或利用干净毛笔，轻轻蘸取保持系花药上的花粉，对雄性不育系及保持系花的柱头进行辅助授粉；5)授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止蜜蜂、昆虫等进入；6)在同一花序上对长至3～5mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；7)最后操作一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系的种子；8)将收获的种子播种于含有Kan的筛选培养基上，筛选萌发正常、子叶与真叶为绿色的幼苗，取其部分叶片进行GUS染色，GUS染色呈蓝色的即为转基因阳性植株(图3)；步骤2)中的侵染液由MS、蔗糖、Silwet、MES、As和L-Cys组成，其中每升MS中加入蔗糖50g、Silwet300μL、MES0.5g、乙酰丁香酮(As)0.2mg和L-半胱氨酸(L-Cys)0.12g，pH为5.8；步骤8)中筛选培养基由MS、蔗糖、Kan和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、Kan500mg、琼脂15mg，pH为5.8。实验1：1)在乌菜‘徽乌11’品种的保持系W11-07-2与雄性不育系Wb11-18、‘徽乌12’品种的保持系W07-16与雄性不育系Wb11-18盛花期时，去各自主花序上已开放的花；保持系植株主花序上选取约4mm大小的花蕾，利用尖头镊子完全剥离萼片与花瓣，露出花药与柱头；2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用含有不同As/L-Cys配比(表1)的基本侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2，室温静置30min；3)利用注射器等工具将不同的侵染液滴至保持系W11-07-2与W07-16的花药上，静置30min、避光处理2天后，对花蕾进行GUS染色(图4)，每个处理30～35个花蕾，重复三次，统计瞬时表达率。表1不同As/L-Cys配比的侵染液对花药GUS瞬时表达率的影响基本侵染液为MS+50mg/L蔗糖+0.03％Silwet+0.5g/LMES本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤1、在乌菜盛花期，去除雄性不育系与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系主花序3～5mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药；步骤2、将含有植物表达载体的农杆菌培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2；步骤3、利用注射器等工具将侵染液滴至花药上，静置30min后，避光处理2天；步骤4、2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉；步骤5、授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止蜜蜂、昆虫等进入；步骤6、在同一花序上对长至3～5mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；步骤7、一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系的种子；步骤8、将收获的种子播种于含有Kan的筛选培养基上，筛选萌发正常、子叶与真叶为绿色的幼苗，取其部分叶片进行GUS染色，GUS染色呈蓝色的即为转基因阳性植株。

【技术特征摘要】
1.一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤1、在乌菜盛花期，去除雄性不育系与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系主花序3～5mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药；步骤2、将含有植物表达载体的农杆菌培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2；步骤3、利用注射器等工具将侵染液滴至花药上，静置30min后，避光处理2天；步骤4、2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉；步骤5、授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止蜜蜂、昆虫等进入；步骤6、在同一花序上对长至3～5mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；步骤7、一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系的种子；步骤8、将收获的种子播种于含有Ka...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国户，汪承刚，曾繁丽，朱世东，袁凌云，侯金锋，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34