低密度脂蛋白的制备方法技术

本发明专利技术适用于生物检测技术领域，提供了一种低密度脂蛋白的制备方法，包括如下步骤：向血清中加入大分子化合物，除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白；然后用金属离子沉淀低密度脂蛋白；再用缓冲液和金属离子溶解沉淀，并去除白蛋白等少量杂质蛋白，最后进行低密度脂蛋白的纯化。借此，本发明专利技术能够提高低密度脂蛋白的制备速率，制备成本低、时间短，纯化产物产出量高。

Preparation of Low Density Lipoprotein

The invention is applicable to the field of biological detection technology, and provides a preparation method of low density lipoprotein, including the following steps: adding macromolecule compounds to the serum to remove serum lipoproteins other than low density lipoproteins and high density lipoproteins; then precipitating low density lipoproteins with metal ions; then dissolving precipitation with buffer solution and metal ions, and removing a small amount of albumin, etc. The impurity proteins were purified finally. Therefore, the invention can improve the preparation rate of high and low density lipoproteins, has low preparation cost, short preparation time and high output of purified products.

【技术实现步骤摘要】
低密度脂蛋白的制备方法
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种低密度脂蛋白的制备方法。
技术介绍
低密度脂蛋白(LDL)升高是心血管疾病发生的重要影响因素，低密度脂蛋白的检测及载脂蛋白B的检测是最常用的检测血脂水平的方法；在检测以上指标时，需要一定纯度及完全活性的低密度脂蛋白作为校准品和质控品。目前，绝大多数低密度脂蛋白测定方法是超速离心法和聚乙二醇沉淀法，这些方法都需要用到超速离心机，超速离心机在使用过程中，需要20个小时左右才能够将低密度脂蛋白或者低密度脂蛋白的中间制备产物分离，耗时较长；同时，超速离心机一般价格昂贵，且使用寿命比较短，提高了制备成本；这些方法在实施过程中需要用到包括超速离心机在内的多种仪器，操作繁琐，对工作人员的技术要求高；另外，现有技术制备的低密度脂蛋白产量比较低。综上可知，现有技术在实际应用中显然存在不足之处，有必要加以改进。
技术实现思路
针对上述技术缺陷，本专利技术的目的在于提供一种低密度脂蛋白的制备方法，其采用大分子化合物除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白，并结合其他方法进一步纯化低密度脂蛋白，使用的仪器、设备和试剂耗材少，制备成本低，操作简单，适合低密度脂蛋白的批量纯化；低密度脂蛋白的制备可在2小时内完成，制备时间短，效率高；纯化产物产出量高，在88.5％以上。为了实现上述目的，本专利技术提供一种低密度脂蛋白的制备方法，包括如下步骤：步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白向血清中加入大分子化合物，大分子化合物的浓度为0.1～10％，混匀后离心，取一次上清液。步骤二沉淀低密度脂蛋白向所述一次上清液中加入金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取一次沉淀。步骤三沉淀混合物的溶解向所述一次沉淀中加入缓冲液和所述金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取二次上清液；所述缓冲液与所述一次沉淀的体积比为0.8～1.3:10。步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除向所述二次上清液中加入非选择性沉淀剂，进行沉淀反应，反应完全后进行离心，然后取二次沉淀；向所述二次沉淀中加入所述缓冲液和所述金属离子，搅拌溶解，得到低密度脂蛋白；所述缓冲液与所述二次沉淀的体积比为0.4～0.9:10。步骤五纯化低密度脂蛋白采用国家标准检测方法对所述低密度脂蛋白进行纯化，并计算纯化产出量。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，所述金属离子的浓度为0.01～0.1mol/L。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，所述金属离子为NaCl、KI、KCL、NaI、KBr、MgCl2、CaCl2、MnCl2中的任意一种。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，所述金属离子为MgCl2、CaCl2、MnCl2中的任意一种。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，所述大分子化合物与所述血清的体积比为1～10:100。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，离心过程中，离心机的转速为9000～11000r/min，离心时间为3～10min。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，所述缓冲液的pH为5.0～9.0，所述缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，所述非选择性沉淀剂的浓度为1.0～5.0％。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，所述非选择性沉淀剂的加入量为所述二次上清液体积的3～9％。根据本专利技术的低密度脂蛋白的制备方法，所述非选择性沉淀剂为硫酸铵、硫酸钠或聚乙二醇中的任意一种本专利技术的有益效果为：1、本专利技术采用大分子化合物除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白，并结合其他方法进一步纯化低密度脂蛋白，使用的仪器少，整个操作过程简单，对工作人员的技术要求低，提高低密度脂蛋白的制备速率。2、本专利技术使用的离心机为高速离心机，也不需要其他精密仪器，使用的试剂为常见试剂，因此，设备和试剂等耗材少，制备成本低，适合低密度脂蛋白的批量纯化。3、本专利技术可在2小时内完成，制备时间短，效率高。4、本专利技术的方法制备的低密度脂蛋白纯化产物产出量高，在88.5％以上。附图说明图1是本专利技术低密度脂蛋白的制备流程图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供了一种低密度脂蛋白的制备方法，包括如下步骤：步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白向血清中加入大分子化合物，混匀后离心，取一次上清液。大分子化合物能够与血清中除低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白发生沉淀反应，而低密度脂蛋白和高密度脂蛋白存在于一次上清液中。大分子化合物与血清的体积比为1～10:100；大分子化合物选用肝素、PVP、DS中的任意一种或者几种，大分子化合物的浓度为0.1～10％，为了促进离心效果，作为一种优选的方案，大分子化合物选用肝素、PVP、DS中的任意两种，且经过多次试验，肝素和DS两种大分子化合物混合使用时，离心效果最好，低密度脂蛋白产出量最高，且肝素和DS的体积比为1:4～7。采用不溶血血清，血清采集后应尽快分析，当天不能检测的血清在2～8℃条件下可贮存5～7天，-20℃条件下可贮存25～30天，只能解冻一次检测。步骤二沉淀低密度脂蛋白向步骤一中得到的一次上清液中加入金属离子，搅拌溶解，搅拌溶解的时间为5～10min，溶解后进行离心，然后取一次沉淀。金属离子可以与低密度脂蛋白生成沉淀，经过离心后将高密度脂蛋白去除。步骤三沉淀混合物的溶解向步骤二制得的一次沉淀中加入缓冲液和金属离子，搅拌溶解，搅拌溶解的时间为5～10min，溶解后进行离心，然后取二次上清液；缓冲液和金属离子共同作用，能够将沉淀中的低密度脂蛋白溶解出来。步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除向步骤三制得的二次上清液中加入非选择性沉淀剂，进行沉淀反应，反应时间为5～10min，反应完全后进行离心，然后取二次沉淀；二次上清液中还存在少量白蛋白等杂质，在二次上清液中加入非选择性沉淀剂，沉淀低密度脂蛋白，除去白蛋白等杂质；向二次沉淀中加入缓冲液和金属离子，搅拌溶解，得到低密度脂蛋白。非选择性沉淀剂的加入量为二次上清液体积的3～9％，非选择性沉淀剂的浓度为1.0～5.0％；非选择性沉淀剂为硫酸铵、硫酸钠或聚乙二醇中的任意一种。本专利技术中的离心机选用高速离心机，转速为9000～11000r/min，离心时间为3～10min。本专利技术中的缓冲液可选Tris缓冲液、PB缓冲液或其他缓冲液，缓冲液的pH为5.0～9.0，缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L；缓冲液与一次沉淀的体积比为0.8～1.3:10；缓冲液与二次沉淀的体积比为0.4～0.9:10。本专利技术中的金属离子的浓度为0.01～0.1mol/L，金属离子为NaCl、KI、KCL、NaI、KBr、MgCl2、CaCl2、MnCl2中的任意一种。经过多次试验，在步骤二中，二价金属离子的沉淀效果较一价金属离子更好，在步骤三和步骤四中，二价金属离子的溶解效果较一价金属离子更好，因此，作为一种优选的方案，金属离子为MgCl2、CaCl2、MnCl2中的任意一种。步骤五纯化低密度脂蛋白采用国家标准检测方法对步骤四中的低密度脂蛋白进行纯化，并计算纯化产出量。为获取最佳实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白向血清中加入大分子化合物，大分子化合物的浓度为0.1～10％，混匀后离心，取一次上清液；步骤二沉淀低密度脂蛋白向所述一次上清液中加入金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取一次沉淀；步骤三沉淀混合物的溶解向所述一次沉淀中加入缓冲液和所述金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取二次上清液；所述缓冲液与所述一次沉淀的体积比为0.8～1.3:10；步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除向所述二次上清液中加入非选择性沉淀剂，进行沉淀反应，反应完全后进行离心，然后取二次沉淀；向所述二次沉淀中加入所述缓冲液和所述金属离子，搅拌溶解，得到低密度脂蛋白；所述缓冲液与所述二次沉淀的体积比为0.4～0.9:10；步骤五纯化低密度脂蛋白采用国家标准检测方法对所述低密度脂蛋白进行纯化，并计算纯化产出量。

【技术特征摘要】
1.一种低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白向血清中加入大分子化合物，大分子化合物的浓度为0.1～10％，混匀后离心，取一次上清液；步骤二沉淀低密度脂蛋白向所述一次上清液中加入金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取一次沉淀；步骤三沉淀混合物的溶解向所述一次沉淀中加入缓冲液和所述金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取二次上清液；所述缓冲液与所述一次沉淀的体积比为0.8～1.3:10；步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除向所述二次上清液中加入非选择性沉淀剂，进行沉淀反应，反应完全后进行离心，然后取二次沉淀；向所述二次沉淀中加入所述缓冲液和所述金属离子，搅拌溶解，得到低密度脂蛋白；所述缓冲液与所述二次沉淀的体积比为0.4～0.9:10；步骤五纯化低密度脂蛋白采用国家标准检测方法对所述低密度脂蛋白进行纯化，并计算纯化产出量。2.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述金属离子的浓度为0.01～0.1mol/L。3.根据权利要求2所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，刘振国，周立忠，
申请(专利权)人：潍坊泽成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37