一种提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法技术

本发明专利技术提供一种提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法。该方法通过种皮开裂的性状筛选出成苗率极低的组间杂交种子，采用离体胚培养技术将其快速培养成苗，从而提高组间杂交种子的成苗率、缩短育种周期。研究发现IAA、GA3、活性炭组合对种胚离体成苗具有促进作用，并获得了最佳的离体胚成苗培养基。该培养基下种胚根系可以快速伸长，真叶萌发，使种胚快速成苗，平均胚苗真叶长达2.49cm，平均根长达4.74cm。传统育苗方式下成苗率极低的种皮开裂种子在本方法下可在40天内快速成苗，且移栽成活后的幼苗叶片硕大，生长势强，从而提高远缘杂交种子总成苗率，加快新品种的育种进程。

A Method for Increasing Seedling Rate of Inter-group Distant Hybridization of Paeonia

The invention provides a method for improving the seedling rate of distant hybrid seeds of Paeonia. The method screened out the interspecific hybrid seeds with very low seedling rate through the characteristics of seed coat cracking, and used in vitro embryo culture technology to rapidly cultivate them into seedlings, thus improving the seedling rate of interspecific hybrid seeds and shortening the breeding cycle. It was found that IAA, GA3 and activated carbon combination could promote in vitro seedling formation of seed embryos, and the best medium for in vitro embryo seedling formation was obtained. Under this medium, the root system of embryo can grow rapidly, the true leaf germinates, and the embryo can grow into seedlings quickly. The average true leaf length of embryo seedlings is 2.49 cm, and the average root length is 4.74 cm. Under this method, cracked seeds with very low seedling rate can grow rapidly within 40 days, and the seedlings with large leaves and strong growth potential after transplantation can improve the total seedling rate of distant hybrid seeds and speed up the breeding process of new varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法
本专利技术涉及组织培养技术及育种领域，具体地说，涉及一种提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法。
技术介绍
牡丹(Paeoniasect.Moutan)是我国的传统名花，花大色艳，具有“国色天香”的美誉，隶属芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)，该属分为牡丹组(Sect.Moutan)、芍药组(Sect.Paeonia)和北美芍药组(Sect.Onaepia)(洪德元,1999)。牡丹组下再分为两个亚组，及革质花盘亚组(subsect.Vaginatae)和肉质花盘亚组(subsect.Delavayanae)(王连英等，1997；李嘉珏，1999)。组间杂交是指牡丹组与芍药组的远缘杂交，相较于亚组内或品种群的近缘杂交，组间杂交难度系数大。这类杂交组合得到的后代为组间杂种，组间杂种兼具牡丹与芍药的特征，株形优美、花叶繁茂，花大色艳，从白色、粉红色、珊瑚色、淡紫色、紫红色、红色到橘黄色与黄色等均有，以黄色为主，花瓣基部带有明显异色的斑纹，并且同一朵花上有不同颜色嵌合现象，花型多为单瓣或蔷薇型，开花期在牡丹与芍药花期之间，开花晚、花期长，延长了牡丹品种的观赏期、丰富了观赏性(孙菊芳等，2007)，组间远缘杂交育种已成为牡丹育种的重要发展方向。自1948年日本育种家KochiItoh开创芍药属组间杂交育种先河以来，经过多年育种家的努力，目前美国牡丹芍药协会(http://www.americanpeonysociety.org)已登录的组间杂种共117个，我国组间杂交育种起步较晚，截至2016年国内只有6个品种发表(荆丹丹，2010；钟原等，2016)。组间杂交成功率普遍较低，曾被认为是“不可能的梦想”。关于牡丹芍药组间远缘杂交育种情况如表1所示，根据前人研究总结可知，牡丹芍药组间远缘杂交育种难度大，后代饱满种子数量少，结实率低，不同组合出苗率不同，平均出苗率低，且研究中发现亚组间高代杂种作父本与芍药的组间杂交组合中，部分存在高结实率低出苗率的情况，在筛选出亲和性高的亲本条件下，将大量不能萌发的饱满种子培养成苗是提高育种效率的重要途径，而识别不萌发的种子、采用离体胚培养代替常规大田育苗是其关键的两步。关于牡丹离体胚培养成苗的研究情况如表2所示，研究对象较为局限，主要是紫斑牡丹或‘凤丹’，不同方案下成苗周期、成苗率不同，成苗周期最短为40天，成苗率最高可达93.75％，但移栽成活率的数据较少，若无移栽成活率数据难以证明方案的可行性，目前该技术最高效、快捷的方案是紫斑牡丹：改良MS(钙加倍、大量元素加倍)+0.6g/LAC+0.5mg/LGA，‘凤丹’：改良MS(钙加倍、大量元素加倍)+0.6g/LAC+1.0mg/LGA，可在40天内使成苗率达到93.75％、63.88％；且移栽成活率最高可达100％、66.34％(徐莉,2017)。由紫斑牡丹和‘凤丹’的差异可知不同基因型离体胚培养效果差异明显，该方案对其它基因型的胚培养成苗具有参考价值，但还需依具体情况进行调整与完善，目前未见将该技术应用于远缘杂交育种范畴内的成功案例。综上，采用传统育苗方式育种存在以下不足：1、出苗率低：传统育苗方式在播种时未对种皮完整及开裂的种子进区分，未识别难以萌发的种子；受自然条件影响大，如降雨、温度、光照、土壤条件等。如何桂梅(2016)在2年中同一杂交组合生根率差异较大，第一年为65.4％，第二年只有10.9％；肖佳佳(2010)进行牡丹与芍药组间远缘杂交，获得761粒种子，成苗率仅为4.86％。2、育种周期长：传统育苗方式下种子播种后需3个月左右才能萌发生根，次年开春上部才萌发真叶，后期杂种鉴定工作进程慢，育种周期长。3、胚离体培养体系尚待完善，没有应用到芍药属远缘杂交育种的先例。因此，亟需开发一种专属性强的提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法，该方法通过种皮开裂的性状筛选出难出苗的组间杂交种子，采用离体胚培养技术将其快速培养成苗，从而提高组间杂交种子的成苗率、缩短育种周期。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种芍药属组间远缘杂交种子成苗培养基，所述培养基的配方为：MS培养基+0.2-0.8g/L活性炭+0.25-1.0mg/LGA3+0.25-1.0mg/LIAA+蔗糖30g/L+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0。优选配方为：MS培养基+0.6g/L活性炭+0.5mg/LGA3+0.5mg/LIAA+蔗糖30g/L+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0。其中，所述MS培养基的配方如下：第二方面，本专利技术提供所述成苗培养基的以下任一应用：1)在提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率中的应用；2)在芍药属组间远缘杂交种子组织培养中的应用。优选地，本专利技术所述芍药属组间远缘杂交是指牡丹芍药组间远缘杂交。第三方面，本专利技术提供一种提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法，包括以下步骤：A、芍药属组间远缘杂交，收获杂交种；B、种皮完整的种子采用传统育苗方式，种皮开裂的种子通过离体胚培养成苗。其中，步骤B包括以下子步骤：B1、种子去种皮消毒；B2、种胚培养：采用权利要求1所述成苗培养基进行种胚培养，获得胚苗；B3、移栽成苗。优选地，步骤B1具体为：去掉种皮时根据具体情况保留种脐点，流水冲洗15min，洗涤剂漂洗15min，再用水冲洗15min后置于超净工作台上；用70％酒精浸泡消毒1min，然后用5％次氯酸钠溶液分两次摇荡消毒，然后用无菌水冲洗5次。步骤B2具体为：从消毒后的种子中取种胚，接种于所述成苗培养基中培养40天。培养条件为：温度25±4℃，光照强度32.4umol·m-2·s-1，光照时数为14h/d。步骤B3具体为：将胚苗移栽到经灭菌的珍珠岩：蛭石：草炭土＝1:1:1体积比的混合基质中，移栽苗在人工气候室中培养。移栽培养1月后统计移栽成活率。所述人工气候室的培养条件为：温度20±1℃，湿度90％，光照强度32.4umol·m-2·s-1，光照时数为14h/d。步骤A中杂交组合为‘MarthaW.’בGoldenEra’，‘MarthaW.’ב牡丹亚组间高代杂种07-LB-1’或‘MarthaW.’בBlackPirate’。优选地，所述杂交组合中以‘MarthaW.’为母本。在本专利技术的一个具体实施方式中，提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法如下：1、组间远缘杂交选择杂交组合‘MarthaW.’בGoldenEra’，‘MarthaW.’×牡丹亚组间高代杂种(07-LB-1)，及‘MarthaW.’×美国培育的亚组间远缘杂种(‘BlackPirate’)，采用常规杂交育种方法进行芍药属组间远缘杂交，在4月下旬，进行父本花粉采集，去掉母本芍药的侧蕾，在母本花蕾处于风铃期或露色期时，花蕾变得松软，去除花瓣及雄蕊，套袋。母本套袋三天后，待柱头开始分泌粘液时授粉，连续授粉三天。在8月中旬，当果皮呈蟹黄色并微裂、种皮呈棕色时采收，于室内晾干，收获种子。2、种子的成苗①杂交种子的筛选区分：将杂交收获的去掉空瘪后的饱满种子，区分为种皮完整和种皮开裂两种类型；②种子的成苗：种皮完整种子采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.芍药属组间远缘杂交种子成苗培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：MS培养基+0.2‑0.8g/L活性炭+0.25‑1.0mg/L GA3+0.25‑1.0mg/L IAA+蔗糖30g/L+7.5g/L琼脂，pH5.8‑6.0；优选配方为：MS培养基+0.6g/L活性炭+0.5mg/L GA3+0.5mg/L IAA+蔗糖30g/L+7.5g/L琼脂，pH5.8‑6.0；其中，所述MS培养基的配方如下：

【技术特征摘要】
1.芍药属组间远缘杂交种子成苗培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：MS培养基+0.2-0.8g/L活性炭+0.25-1.0mg/LGA3+0.25-1.0mg/LIAA+蔗糖30g/L+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；优选配方为：MS培养基+0.6g/L活性炭+0.5mg/LGA3+0.5mg/LIAA+蔗糖30g/L+7.5g/L琼脂，pH5.8-6.0；其中，所述MS培养基的配方如下：2.权利要求1所述成苗培养基的以下任一应用：1)在提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率中的应用；2)在芍药属组间远缘杂交种子组织培养中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述芍药属组间远缘杂交是指牡丹芍药组间远缘杂交。4.一种提高芍药属组间远缘杂交种子成苗率的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、芍药属组间远缘杂交，收获杂交种；B、种皮完整的种子采用传统育苗方式，种皮开裂的种子通过离体胚培养成苗；其中，步骤B包括以下子步骤：B1、种子去种皮消毒；B2、种胚培养：采用权利要求1所述成苗培养基进行种胚培养，获得胚苗；B3、移栽成苗。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B1具体为：去掉种皮时...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟原，徐莉，成仿云，杜明杰，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11