用于改变凝聚型聚集丝状真菌的形态的方法技术

本发明专利技术的目的是用于改变凝聚型聚集丝状真菌的形态的方法，包括：a)将所述丝状真菌的孢子包封在油包水乳状液的分散相中，b)使包封的孢子在所述乳状液的分散相中萌发，c)回收非聚集的萌发的孢子，所述乳状液是通过使用微流体装置获得的，d)在液体培养基中培养萌发的孢子。

【技术实现步骤摘要】
用于改变凝聚型聚集丝状真菌的形态的方法
本专利技术涉及通过将孢子包封在微流体乳状液中来改变凝聚型(coagulanttype)聚集丝状真菌的形态的方法。
技术介绍
丝状真菌目前用于生产酶，所述酶能够例如在生产生物燃料的背景中催化生物质转化为乙醇，或生产在食品工业中有用的各种酸。米曲霉（Aspergillusoryzae）使得能够例如生产在生物燃料生产工业以及化学和食品工业（例如：天冬酰胺酶，其使得能够降低食物中丙烯酰胺的水平）中有用的各种酶（纤维素酶、淀粉酶）。一些最近的出版物也显示了其用于生产C4二羧酸（苹果酸、富马酸、琥珀酸）的潜在价值。丝状真菌的形态能够对菌株的生产力具有直接影响，这主要是通过改变菌丝体内的氧和营养物的转运。通常，区分出这些真菌的两种类型的形态：称为游离菌丝体的非聚集形态，以及可以以多个球形聚集体（称为菌球(pellet)）的形式或以单个聚集体的形式出现的聚集形态。取决于所考虑的真菌的物种，聚集可以在生长的各个阶段，在孢子萌发之前和期间的所谓“早熟”阶段，或者在当已经形成菌丝体时的更晚期阶段发生。因此，在萌发期间孢子之间聚集有效的物种被称为“凝聚”型物种，而仅后来在菌丝体生长期间聚集的那些被归类为“非凝聚”型物种。以聚集形式出现的真菌具有影响它们的生产力的扩散限制。因此，控制丝状真菌的形态以确保游离菌丝体的产生，将代表在管理用于使用这些真菌生产酶的方法中的显著优势，从而改进它们的生产力并促进它们在生物反应器中的培养。目前，在文献中没有关于通过采用微流体技术控制具有聚集形态的丝状真菌的形态的研究。
技术实现思路
本专利技术提出使用微流控技术（microfluidics），以便在丝状真菌的孢子萌发期间在乳状液内物理分离它们。在萌发结束时，乳状液的去稳定和芽管(germtube)的回收以及随后它们的培养使得能够为通常表现出聚集形式生长的某些物种获得流体生长。以流体形式生长，促进了真菌的培养，并且使得能够改进使用它们的方法的生产力。因此，本专利技术的目的是用于改变凝聚型聚集丝状真菌的形态的方法，包括：a)将所述丝状真菌的孢子包封在油包水乳状液的分散相中，b)使包封的孢子在所述乳状液的分散相中萌发，c)回收非聚集的萌发的孢子，所述乳状液是通过使用微流体装置获得的，d)在液体培养基中培养萌发的孢子。在本申请的上下文中，微流控技术定义为使用几十微米大小的通道来操作小体积流体（10-9至10-18升）的系统的技术。Beneyton等人在2016年描述了使用微流控技术来包封物种黑曲霉(Aspergillusniger)的孢子，用于通过荧光进行突变菌株的高速酶促筛选。将进行了随机诱变的大量孢子分开地包封在培养基的液滴内，分散在连续的油相中。在它们生长期间，液滴中含有的荧光底物的降解使得能够评价包封的真菌对酶的生产，并且因此使得能够选择群体中最有效的突变菌株。Beneyton等没有描述使用这种技术来改变丝状真菌的形态。根据本专利技术的方法使得天然形成聚集体的丝状真菌的形态能够通过在它们的发育期间（=凝聚型）重新组合孢子来改变。本专利技术的目的是通过在萌发之前和萌发期间将孢子彼此物理分离来防止并且甚至抑制这种聚集，所述物理分离是通过将孢子包封在通过微流控技术获得的油包水乳状液中。附图说明图1图示了用于在“流动聚焦(flow-focusing)”中的连接处形成液滴的典型布置。图2图示了用于本专利技术实施例中的微流体装置。图3是通过采用根据本专利技术的方法获得的孢子包封的显微镜图像。图4是在实施例2的条件下观察到的一系列米曲霉培养物的锥形瓶照片：4A)和4B)图示了对照培养物，4C)图示了从本专利技术的包封方法获得的孢子的培养物。图5显示了在实施例2的条件下观察到的米曲霉培养物的用双筒放大镜获得的照片：5A)对照培养物的样品，5C)通过本专利技术的包封方法获得的培养物的样品。图6是在实施例3的条件下观察到的一系列土曲霉(Aspergillusterreus)培养物的锥形瓶照片：6A)和6B)图示了对照培养物，6C)图示了通过本专利技术的包封方法获得的孢子的培养物。图7显示了在实施例3的条件下观察到的土曲霉培养物的双筒放大镜下照片：7A)对照培养物的样品，7C)通过本专利技术的包封方法获得的培养物的样品。具体实施方式具有聚集形态的丝状真菌在本申请的上下文中，属于凝聚型的聚集形态的丝状真菌理解为意指其中孢子未萌发并且在萌发期间彼此自然聚集的真菌。根据一个优选的实施方案，具有聚集形态的丝状真菌选自物种米曲霉、黑曲霉或构巢曲霉（Aspergillusnidulans），并且更优选来自属于物种米曲霉的菌株。丝状真菌的孢子用于本方法的背景中。孢子可在用于本专利技术方法之前过滤，从而除去可能存在的任何菌丝体。包封根据本专利技术的用于改变丝状真菌形态的方法包括将真菌的孢子包封在油包水乳状液的分散相中的第一个步骤。乳状液是通过使用微流体装置获得的。乳状液的分散相是水相，其至少包含水、要被包封在液体培养基中的悬浮液中的真菌的孢子。培养基可以是本领域技术人员已知的任何培养基，以允许作为本申请主题的丝状真菌萌发。它可以是例如含有复合营养物的来源（例如：酵母提取物，蛋白胨）的丰富培养基或含有指定化合物（例如：矿物盐，含碳和含氮化合物）的基本培养基。它可以是例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基，其包含24g/l的马铃薯葡萄糖、5g/l的蛋白胨和5g/l的酵母提取物。乳状液的油相包含至少一种不影响微生物生长的生物相容性油。特别地，油相包含至少一种氟化油。事实上已知氟化油对于与微生物一起使用是生物相容的（参见例如BaretJ.-C.,Surfactantsindroplet-basedmicrofluidics,Labonachip,2012,12(3),p.422）。氟化油可选自全氟烷、全氟胺和全氟醚。优选地，所述氟化油可选自全氟戊烷、全氟己烷、全氟三丙胺和全氟聚醚。根据一个优选的实施方案，油相包含氟化油，例如由3M公司以名称FluorinertFC-3283销售的氟化油。除油之外，油相含有至少一种表面活性剂，其使得分散在油相中的水相液滴能够被稳定。表面活性剂可优选选自生物相容性表面活性剂。优选地，表面活性剂是氟化表面活性剂，例如由Dolomite公司以Picosurf的名称销售的表面活性剂。根据本专利技术的乳状液通过微流控技术获得，即，通过使用小型化系统，其使得能够在根据特定几何图案布置的微通道内以可再现和受控的方式在流动条件下产生微滴。这些几何布置是本领域技术人员公知的。在用于产生微滴流的最常规方法中，可以提及T形连接和流动聚焦几何结构。根据一个优选的实施方案，根据本专利技术的乳状液用具有流动聚焦几何结构的微流体系统获得。在这种类型的系统中，分散相被共线性地注入到围绕它的两个油流中。根据所选择的实验条件，可以在两个油流之间形成分散相的射流。由此形成的层状共流经过收缩部，收缩部强化了流动并且可能导致分散相的射流破碎成液滴。因此，在流动聚焦几何结构中，液滴优选形成在十字形连接处等。这种类型的系统图示于例如图1。根据本专利技术的微流体装置特别包括：-供入了水相的第一微流体导管，所述水相在悬浮液中包含要包封的孢子；-供入了油相的第二微流体导管；第一导管导入第二导管并与后者形成流体连接。由于两个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于改变凝聚型聚集丝状真菌的形态的方法，包括：a) 将所述丝状真菌的孢子包封在油包水乳状液的分散相中，b) 使包封的孢子在所述乳状液的分散相中萌发，c) 回收非聚集的萌发的孢子，所述乳状液是通过使用微流体装置获得的，d) 在液体培养基中培养萌发的孢子。

【技术特征摘要】
2017.09.27 FR 17589241.用于改变凝聚型聚集丝状真菌的形态的方法，包括：a)将所述丝状真菌的孢子包封在油包水乳状液的分散相中，b)使包封的孢子在所述乳状液的分散相中萌发，c)回收非聚集的萌发的孢子，所述乳状液是通过使用微流体装置获得的，d)在液体培养基中培养萌发的孢子。2.根据权利要求1的方法，其特征在于凝聚型聚集形态的丝状真菌优选选自物种米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)或构巢曲霉（Aspergillusnidulans），并且更优选来自属于物种米曲霉的菌株。3.根据权利要求1或2的任一项的方法，其特征在于乳状液的分散相是水相，其至少包含水、要被包封在液体培养基中的悬浮液中的真菌的孢子。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于乳状液的油相包含至少一种不干扰微生物生长的生物相容性油，优选至少一种氟化油。5.根据权利要求4的方法，其特征在于油相包含至少一种表面活性剂，优选生物相容性表面活性剂。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于微流体装置包括供入了水相的第一微流体导管和供入了油相的第二微流体导管，所述水相在悬浮液中包含要包封的孢子，第一导管开口到第二导管中并与后者形成流体连接。7.根据权利要求6的方法，其特征在于第一和第二微流体导管具有可以内接于直径为1μm至1mm，优选50至500μm，特别是大约125μm的圆的横截面。8.根据权利要求3-7的任一项的方法，其特征在于乳状液的水相是分散在油相中的液滴的形式，所述液滴具有10μm至1mm，优选50至500μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：M德鲁加尔，E安德烈，E茹尔迪耶，MF本沙班，N潘纳奇，
申请(专利权)人：IFP新能源公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR