一种模拟微生态的益生菌的筛选方法，包括如下步骤：微生物益生菌培养；微生物益生菌固定化胶球的制备；微生物益生菌耐重金属性检测；微生物益生菌检测：将分离出的微生物益生菌进行活性检测，确定强耐重金属的微生物益生菌为枯草芽孢杆菌CGMCC No.5155、蜡状芽孢杆菌CGMCC No.13007及芽孢杆菌CGMCC No.15612；耐重金属益生菌反向筛选最佳配比。本发明专利技术采用反向筛选模型的方法筛选生物菌和修复剂配方，并采用固定化的方法将生物菌及其他成分制备成固定化小球施于重金属污染土壤中，制备的土壤复合修复剂能够显著地降低土壤活性态重金属，并使杂交水稻铅、镉的含量达标。
【技术实现步骤摘要】
一种模拟微生态的益生菌的筛选方法、修复剂及其应用
本专利技术涉及污染土壤的再生
，尤其涉及一种模拟微生态的益生菌的筛选方法、修复剂及其应用。
技术介绍
土壤微生物在土壤生物中占据主导地位。土壤中存在着数目庞大、结构复杂的微生物群落。土壤微生物在与植物共进化过程中形成共生关系，在促进植物生长、防控植物疾病、减少土壤与农作物有机无机污染、调节酸碱度等方面发挥重要作用。工业益生菌的获得有很多方法，常用方法为：富集分离、纯化—小试规模验证功能—通过毒理试验—扩大试验规模验证功能—获得工程化数据—注册，生产。相比而言，益生菌在农业上的应用具有更大的难度，原因是农业生态多变、不具有工业那样的人为可控制性，如土壤、土壤中的生物(含植物、微生物与小型动物)皆受到多变的环境影响。因此普遍的现象就是，农用益生菌田间效果不稳定，与实验室的效果相差甚远，导致多数的实验室工作白废。另外，现有技术得到新型有效微生物的机率越来越低，重要的原因是获取微生物的过程中微生物脱离了原生态的物理化学生物环境：模拟环境不可能复制真实环境，如养分浓度过高，活性氧毒害，微生物间的相互作用如共生、互生缺失，等等。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供一种模拟微生态的益生菌的筛选方法、修复剂及其应用，采用反向筛选模型的方法筛选生物菌，将离体筛选模型和活体筛选模型相结合，并采用固定化的方法将筛选的生物菌及其他成分固定在小球载体内施于被重金属污染的土壤中，从而显著地降低土壤活性态重金属，并使杂交水稻铅、镉的含量达标。本专利技术所述的技术问题是以如下技术方案解决的：一种模拟微生态的益生菌的筛选方法，包括如下步骤：a、微生物益生菌培养：100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液，将海藻酸钠、黄原胶、重金属污染土壤、黏土矿物、生物炭、腐植酸、肉汤培养基(NB)和植物培养基(MS)按比例加入浸提液中，混合均匀，并加入水稻种子，向混合物中加入质量分数为1-2％的CaCl2，进行固化，培养7-10天，长出微生物；将培养的微生物进行分离纯化，筛选得到16种益生菌，剔除溶血实验阳性的10株菌，保藏6株菌；b、微生物益生菌固定化胶球的制备：将100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液；以浸提液按比例分别配置4％的海藻酸钠、肉汤培养基(NB)、马铃薯培养基(PDB)和植物培养基(MS)，将各培养基进行等量混合，向混合培养基中按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸；将步骤a培养的微生物益生菌和保藏号为CGMCCNo.5155的环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)一同加入到混合培养基中，同时将以步骤a培养的微生物益生菌进行浸泡露白的拟南芥种子加入混合培养基中，混合均匀，将混合液通过枪头注入到2％的CaCl2溶液中，留置4h，制成固定化胶球；c、微生物益生菌耐重金属性驯化：将步骤b制备的微生物益生菌固定化胶球装入层析柱中，向柱内连续流入0.6mg/kg的镉和256mg/kg的铅，稀释率D为0.1，停留时间为10个循环的时间，测定流出液中镉、铅的含量，并以肉汤培养基、马铃薯培养基分离流出液中的微生物益生菌；然后，逐次增加镉和铅的含量，镉分别由2mg/kg、8mg/kg至16mg/kg、铅分别对应由512mg/kg、1028mg/kg至2048mg/kg，三轮稀释率D仍为0.1，停留时间仍为10个循环的时间，分离流出液中的微生物益生菌；d、耐重金属益生菌检测：将分离出的微生物益生菌进行活性检测，确定强耐重金属的微生物益生菌均为芽孢杆菌，分别为环状芽孢杆菌、蜂房类芽孢杆菌和芽孢杆菌，所述环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)原初分离时成半颗玻璃珠状，经多次诱变驯化后，呈厚的较粘稠状态，仍为圆形，表面粗糙不透明，呈污白色，其保藏号为CGMCCNo.5155，于2011年8月17日保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；所述蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillusalvei)呈圆形或近圆形，稍有光泽的白色菌落，其保藏号为CGMCCNo.13007，于2016年9月13日保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；所述芽孢杆菌(Bacillussp.)呈圆形，粗糙类似毛玻璃状，可对重金属进行生物矿化，其保藏号为CGMCCNo.15612，于2018年4月12日保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；e、耐重金属益生菌反向筛选最佳配比：以肉汤培养基融化海藻酸钠，按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸，放至40℃，将步骤d得到的微生物菌株按不同比例加入到培养基中，混匀，利用蠕动泵将混合物滴入2％的CaCl2溶液中，在4℃条件下硬化储藏，制备成土壤修复剂胶球，盆栽试验确定菌株的最佳配比。上述模拟微生态的益生菌的筛选方法，所述步骤a中，海藻酸钠：黄原胶：重金属污染土壤：黏土矿物：生物炭：腐植酸的配比为6:1:1:1.5:6:1.5，相对应的肉汤培养基和植物培养基的体积为20mL。上述模拟微生态的益生菌的筛选方法，所述步骤a、b中，黏土矿物：生物炭：腐植酸的配比为1：2-5：1。上述模拟微生态的益生菌的筛选方法，其特征在于：所述修复剂的效能用盆栽试验法测定，盆栽土壤选择与微生物培养用土相同，将土壤复合修复剂胶球施于盆栽土中，将经过益生菌培养基溶液浸种至露白的杂交水稻种子移入盆栽土中进行栽培，观察作物生长状况，并对其进行重金属含量的检测，即可得到修复剂的效能参数。一种由模拟微生态益生菌制备的修复剂，所述复合修复剂为固定化胶体小球，由如下质量份的组分组成：核心微生物10-15份，营养成分1-5份，胶体物质4-10份，生物炭10-50份，黏土矿物5-20份，腐植酸10-20份。上述模拟微生态益生菌制备的修复剂，所述核心微生物包括环状芽孢杆菌，所述环状芽孢杆菌的保藏号为CGMCCNo.5155；蜂房类芽孢杆菌，所述蜂房类芽孢杆菌的保藏号为CGMCCNo.13007；及芽孢杆菌，所述芽孢杆菌的保藏号为CGMCCNo.15612；三种益生菌的质量比CGMCCNo.5155：CGMCCNo.13007：CGMCCNo.15612为1：3：3，环状芽孢杆菌CGMCCNo.5155的有效活菌数为5-10×108cfu/g，蜂房类芽孢杆菌CGMCCNo.13007的有效活菌数为1-3×108cfu/g，芽孢杆菌CGMCCNo.15612的有效活菌数为2-5×108cfu/g，三种益生菌的总有效活菌数≥8-18×108cfu/g；所述黏土矿物：生物炭：腐植酸为1：2-5：1。上述模拟微生态益生菌制备的修复剂，所述胶体物质为海藻酸钠与黄原胶的混合物。上述模拟微生态益生菌制备的修复剂，所述黏土矿物为凹凸棒土或者膨润土。上述模拟微生态益生菌制备的修复剂，所述营养成分为植物培养基(MS)、肉汤培养基(NB)和马铃薯培养基(PDB)三种培养基等量混合的混合物。一种模拟微生态益生菌制备的修复剂的应用，所述修复剂适用于适合农田及集中式饮水源地周边土壤的修复。本专利技术微生物益生菌筛选采用模拟根-土本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种模拟微生态的益生菌的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：a、微生物益生菌培养：100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液，将海藻酸钠、黄原胶、重金属污染土壤、黏土矿物、生物炭、腐植酸、肉汤培养基（NB）和植物培养基（MS）按比例加入浸提液中，混合均匀，并加入水稻种子，向混合物中加入质量分数为1‑2%的CaCl2，进行固化，培养7‑10天，长出微生物；将培养的微生物进行分离纯化，筛选得到16种益生菌，剔除溶血实验阳性的10株菌，保藏6株菌；b、微生物益生菌固定化胶球的制备：将100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液；以浸提液分别配置4%的海藻酸钠、肉汤培养基（NB）、马铃薯培养基（PDB）和植物培养基（MS），将各培养基进行等量混合，向混合培养基中按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸；将步骤a培养的微生物益生菌和保藏号为CGMCC No.5155的环状芽孢杆菌一同加入到混合培养基中，同时将以步骤a培养的微生物益生菌进行浸泡露白的拟南芥种子加入混合培养基中，混合均匀，将混合液通过枪头注入到2%的CaCl2溶液中，留置4h，制成固定化胶球；c、微生物益生菌耐重金属性驯化：将步骤b制备的微生物益生菌固定化胶球装入层析柱中，向柱内连续流入0.6mg/kg的镉和256mg/kg的铅，稀释率D为0.1，停留时间为10个循环的时间，测定流出液中镉、铅的含量，并以肉汤培养基、马铃薯培养基分离流出液中的微生物益生菌；然后，逐次增加镉和铅的含量，镉分别由2mg/kg、8mg/kg至16mg/kg、铅分别对应由512mg/kg、1028mg/kg至2048mg/kg，三轮稀释率D仍为0.1，停留时间仍为10个循环的时间，分离流出液中的微生物益生菌；d、耐重金属益生菌检测：将分离出的微生物益生菌进行活性检测，确定强耐重金属的微生物益生菌均为芽孢杆菌，分别为环状芽孢杆菌、蜂房类芽孢杆菌和芽孢杆菌，所述环状芽孢杆菌原初分离时成半颗玻璃珠状，经多次诱变驯化后，呈厚的较粘稠状态，仍为圆形，表面粗糙不透明，呈污白色，其保藏号为CGMCC No.5155；所述蜂房类芽孢杆菌呈圆形或近圆形，稍有光泽的白色菌落，其保藏号为CGMCC No.13007；所述芽孢杆菌呈圆形，粗糙类似毛玻璃状，可对重金属进行生物矿化，其保藏号为CGMCC No.15612；e、耐重金属益生菌反向筛选最佳配比：以肉汤培养基融化海藻酸钠，按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸，放至40℃，将步骤d得到的微生物菌株按不同比例加入到培养基中，混匀，利用蠕动泵将混合物滴入2%的CaCl2溶液中，在4℃条件下硬化储藏，制备成土壤修复剂胶球，盆栽试验确定菌株的最佳配比。...
【技术特征摘要】
1.一种模拟微生态的益生菌的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：a、微生物益生菌培养：100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液，将海藻酸钠、黄原胶、重金属污染土壤、黏土矿物、生物炭、腐植酸、肉汤培养基（NB）和植物培养基（MS）按比例加入浸提液中，混合均匀，并加入水稻种子，向混合物中加入质量分数为1-2%的CaCl2，进行固化，培养7-10天，长出微生物；将培养的微生物进行分离纯化，筛选得到16种益生菌，剔除溶血实验阳性的10株菌，保藏6株菌；b、微生物益生菌固定化胶球的制备：将100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液；以浸提液分别配置4%的海藻酸钠、肉汤培养基（NB）、马铃薯培养基（PDB）和植物培养基（MS），将各培养基进行等量混合，向混合培养基中按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸；将步骤a培养的微生物益生菌和保藏号为CGMCCNo.5155的环状芽孢杆菌一同加入到混合培养基中，同时将以步骤a培养的微生物益生菌进行浸泡露白的拟南芥种子加入混合培养基中，混合均匀，将混合液通过枪头注入到2%的CaCl2溶液中，留置4h，制成固定化胶球；c、微生物益生菌耐重金属性驯化：将步骤b制备的微生物益生菌固定化胶球装入层析柱中，向柱内连续流入0.6mg/kg的镉和256mg/kg的铅，稀释率D为0.1，停留时间为10个循环的时间，测定流出液中镉、铅的含量，并以肉汤培养基、马铃薯培养基分离流出液中的微生物益生菌；然后，逐次增加镉和铅的含量，镉分别由2mg/kg、8mg/kg至16mg/kg、铅分别对应由512mg/kg、1028mg/kg至2048mg/kg，三轮稀释率D仍为0.1，停留时间仍为10个循环的时间，分离流出液中的微生物益生菌；d、耐重金属益生菌检测：将分离出的微生物益生菌进行活性检测，确定强耐重金属的微生物益生菌均为芽孢杆菌，分别为环状芽孢杆菌、蜂房类芽孢杆菌和芽孢杆菌，所述环状芽孢杆菌原初分离时成半颗玻璃珠状，经多次诱变驯化后，呈厚的较粘稠状态，仍为圆形，表面粗糙不透明，呈污白色，其保藏号为CGMCCNo.5155；所述蜂房类芽孢杆菌呈圆形或近圆形，稍有光泽的白色菌落，其保藏号为CGMCCNo.13007；所述芽孢杆菌呈圆形，粗糙类似毛玻璃状，可对重金属进行生物矿化，其保藏号为CGMCCNo.15612；e、耐重金属益生菌反向筛选最佳配比：以肉汤培养基融化海藻酸钠，按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸，放至40℃，将步骤d得到的微生物菌株按不同比例加入到培养基中，混匀，利用蠕动泵将混合物滴入2%的CaCl2溶液中，在4℃条...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛胜平，田振华，李威茜，翟瑶瑶，李成敏，马玉杰，
申请(专利权)人：河北经贸大学，
类型：发明
国别省市：河北,13
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