一株胞外多糖产生菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产胞外多糖的中度嗜盐菌Planococcus sp.LCB217，其保藏号为KCTC 33861。采用生理生化鉴定等多相分类手段，确定该新种为革兰氏阳性，好氧，呈球状，细胞直径大小为0.6–1.0μm，单菌落呈红橙色，形状呈圆形规则，边缘光滑。该菌株能在含有8%(w/v)NaCl的发酵培养基中产生并分泌胞外多糖，可应用于微生物胞外多糖相关领域。同时，该菌株具有氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、类脂酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶以及胰凝乳蛋白酶等酶活性，可广泛地应用于各类生物工程酶制剂的生产领域。

【技术实现步骤摘要】
一株胞外多糖产生菌及其应用
本专利技术涉及微生物菌种及其应用领域，具体地说，本专利技术涉及一种能产生分泌胞外多糖的中度嗜盐动性球菌及其应用的

技术介绍
微生物胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。相较于动物多糖和植物多糖，微生物产生分泌的多糖具有生产周期短，受地理环境、气候、自然灾害等因素的影响较小，产量及质量都很稳定，性价比较高等优势；因其具有独特的物理学、流变学特性以及使用安全性，故而在食品和非食品工业倍受青睐，同时在医药领域所具有的巨大应用潜能正日益引起人们的广泛关注。近年来，有关微生物胞外多糖的应用探索和新型多糖产生菌的选育从未间断，不断有新的微生物胞外多糖产品被发掘，其应用领域也扩展到石油开采、化工、制药、细菌诊断、免疫及癌症预防等方面。大量研究表明，微生物产生的EPS具有多样化结构多糖的潜在的特殊有益生物活性如抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、免疫调节以及生物絮凝等，已成为医学领域研究的焦点，同时越来越多的EPS被作为商业合成化学药物的替代品。嗜盐微生物所处的高盐极端环境，赋予其独特的生化结构和生存机制。在高盐胁迫下，其物种长期进化过程中，为适应生存环境，经过不断演化，逐渐形成了独特的生物活性物质合成或代谢途径、新的调控机制以及与特异的生理生化相关的新的基因，进而能够产生普通生物没有的生物活性物质。研究表明，嗜极微生物生长在极端环境下，必定会就特殊条件产生应激反应，然后在其细胞表面形成一层胞外多糖“保护膜”，进而可降低低温、高盐、高压等极端环境条件对微生物自身造成的损害。而且，由于现阶段嗜盐菌的相关研究程度比较低，有大量新类型还没有被发行和认识，因而理论研究和应用实践上均具有很大的潜力，尤其是嗜盐新物种，作为新的未被开发的物种类群，其新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着丰富的新颖性和多样性，这为合成分泌具有独特生物活性的胞外多糖提供无限的可能。新的微生物多糖产品的开发、市场拓展以及应用领域的扩大，有赖于微生物多糖产生菌菌种选育、对多糖结构性能和多糖代谢途径的认识以及发酵工艺的优化。为提高微生物多糖产量和加快其产业化进程，我们可以从以下几个方面去努力：（1）继续从自然界中筛选更好的适合发酵的原始出发菌株或者通过诱变育种等手段来获得性能优良的发酵菌种；（2）加强对胞外多糖生物合成途径关键酶的研究，强化表达关键酶的基因或者改变代谢流，从而对现有产生菌进行遗传改造；（3）进一步优化菌种发酵过程工艺参数，以最大力度地提高胞外多糖的产量和质量。
技术实现思路
针对国内外有关微生物胞外多糖的研究现状，本专利技术提供一种新的胞外多糖产生菌。所述的胞外多糖产生菌具有氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶(C4)以及亮氨酸芳胺酶等酶活活性，同时与动性球菌属中已有效发表菌种的16SrRNA基因序列相似度最高，且最高相似度为98.2%，这可明显区别于已公开报道的其它有效菌种。本专利技术提供一株中度嗜盐的动性球菌Planococcussp.LCB217。本专利技术以含有高盐浓度培养基为筛选条件，采用稀释涂布平板法对甘肃省敦煌玉门关的盐碱土中的嗜盐耐盐微生物进行富集培养、分离及纯化，经多级筛选获得一株能分泌胞外多糖的嗜盐菌，即动性球菌Planococcussp.LCB217。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，保藏时间为2016年11月28日，保藏号是KCTC33861，KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和生物技术研究所，邮编是305-806。选择同源关系最近的3株模式菌PlanococcusplakortidisAS/ASP6(II)T,PlanococcusmaitriensisS1T和PlanococcussalinarumISL-16T作为参考菌株，按照《放线菌系统学》和《常见细菌系统鉴定手册》对动性球菌Planococcussp.LCB217进行多相分类鉴定的研究，主要包括形态学特征、生长特性、生理生化特征、极性脂组成、细胞壁肽聚糖类型、呼吸醌醌型、脂肪酸成分以及DNA(G+C)含量等分类鉴定指标分析，同时分别采用APIZYM系统和Biolog系统来测试其酶活特性及碳源利用情况。本专利技术通过提取细菌基因组DNA，经PCR扩增其16SrRNA基因后送样测序，然后将序列上传至EzBioCloud进行在线比对分析。根据分析结果，将与其相似性度较高的相关模式菌株的16SrRNA基因序列从EzBioCloud数据库调出，再利用ClustalW进行多序列匹配排列，并通过软件MEGA5.2以邻近连接法（Neighbor-Joiningmethod,N-J）和最大似然法（MaximumLikelihoodmethod,ML）其构建系统发育树以进一步确定其分类地位。采用Sanger法测定Planococcussp.LCB217的16SrRNA基因序列，测序结果表明其序列全长约为1521bp（GenBank登录号：KX008965）。基于16SrRNA基因的系统发育分析表明Planococcussp.LCB217与动性球菌属的所有模式菌聚集在一起且单独呈一支，且与之相邻分支上亲缘性最近的3株模式菌PlanococcusplakortidisAS/ASP6(II)T,PlanococcusmaitriensisS1T和PlanococcussalinarumISL-16T的16SrRNA基因序列相似度分别为98.2%、97.7%和97.2%，结合表型、生理生化、化学分类及DNA-DNA杂交等比较数据分析可知Planococcussp.LCB217为动性球菌属的一个新种。通过实施本专利技术的具体技术指标，可达到以下预期效果。本专利技术的动性球菌Planococcussp.LCB217为中度嗜盐的好氧菌，革兰氏阳性，运动性，细胞呈直径大小为0.6–1.0μm的球状，单菌落呈红橙色，形状呈圆形规则，边缘光滑。NaCl浓度的生长范围为3–15%（最佳NaCl浓度生长范围为3–5%），生长温度范围为10–45℃（最佳生长温度为30℃），pH生长范围为7.0–9.0（最佳生长pH为9.0）。该菌株能在含有8%(w/v)NaCl的发酵培养基中产生并分泌胞外多糖，同时该菌株还具有氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、类脂酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶以及胰凝乳蛋白酶等酶活性，可广泛地应用于各类生物工程酶制剂及微生物胞外多糖的生产领域。附图说明：图1是菌株Planococcussp.LCB217于扫描电子显微镜20000倍下所观察的形状特征照片。下面举实施例说明本专利技术，但是本专利技术并不限于下述实施例。具体实施方法实施例一：动性球菌Planococcussp.LCB217的筛选和分离样品采自采自甘肃省敦煌玉门关的盐碱土。将1g土样加入装有9mL无菌水的试管中，涡旋振荡，然后用移液枪移取1mL悬液至装有9mL无菌水的试管，依次配制成10-1~10-6倍数的土壤稀释悬液，分别移取100μL涂布于筛选培养基平板上，倒置于37℃下培养72h后，观察菌落的生长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产胞外多糖嗜盐菌Planococcus sp. LCB217，其保藏编号为KCTC 33861。

【技术特征摘要】
1.一株产胞外多糖嗜盐菌Planococcussp.LCB217，其保藏编号为KCTC33861。2.如权利1所述的动性球菌Planococcussp.LCB217，其特征为中度嗜盐的好氧菌，革兰氏阳性，运动性，呈球状，细胞直径大小为0.6–1.0μm，单菌落呈红橙色，形状呈圆形规则，边缘光滑；NaCl浓度的生长范围为3–15%（最佳NaCl浓度生长范围为3–5%），生长温度范围为10–45℃（最佳生长温度为30℃），pH生长范围为7.0–9.0（最佳生长pH为9.0）；吲哚产生和硝酸盐还原实验均为阳性，但MR实验、V-P...

【专利技术属性】
技术研发人员：田永强，甘龙站，王志宽，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51