α-溶血素变体及其用途制造技术

本文描述了具有至少一个突变(诸如突变为正电荷)的α‑溶血素的变体。在某些实例中，所述突变选自成熟、野生型α‑溶血素氨基酸序列中的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合。α‑溶血素变体还可以包括成熟、野生型α溶血素的H144A处的取代和/或跨越残基127至131的一系列甘氨酸残基。还提供了包括α‑溶血素变体的纳米孔组装体，所述组装体具有减少的穿入时间。例如，减少的穿入时间增加DNA测序效率和准确度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】α-溶血素变体及其用途序列表本申请含有已经以ASCII形式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2017年4月17日生成，名为P33551-WO_SL.txt，且大小为43,124字节。
公开了与金黄色葡萄球菌(Staphylococcalaureaus)α-溶血素变体相关的组合物和方法。所述α-溶血素(α-HL)变体可用作例如用于测定聚合物序列信息的设备中的纳米孔组分。本文所述的纳米孔、方法和系统采用具有改善的特征的基于纳米孔的单分子技术提供单链核酸诸如DNA、RNA等的定量检测。背景溶血素是由多种生物体产生的蛋白毒素家族的成员。一些溶血素(例如α溶血素)可以通过在膜中形成孔或通道来破坏细胞膜(例如，宿主细胞膜)的完整性。由成孔蛋白在膜中形成的孔或通道可以用于将某些聚合物(例如，多肽或多核苷酸)从膜的一侧运输到另一侧。α-溶血素(α-HL、a-HL或alpha-HL)是在宿主细胞膜中形成通道的自组装毒素。α-HL已成为纳米孔测序界的主要组分。它具有许多有利的性质，包括高稳定性、自组装和足够宽以容纳单链DNA、但不容纳双链DNA的孔径(Kasianowicz等人,1996)。以前关于a-HL孔中DNA检测的工作已经集中在分析随着DNA通过孔转移的离子电流特征(Kasianowicz等人,1996,Akeson等人,1999,Meller等人,2001)，考虑到转移速率(在100mV为~1nt/μs)和离子电流信号中的固有噪声，这是一项非常困难的任务。通过并入永久束缚到孔内部的探针分子，已经在基于纳米孔的传感器中实现了更高的特异性(Howorka等人,2001a和Howorka等人,2001b;Movileanu等人,2000)。野生型a-HL导致显著数目的缺失错误，即没有测量到碱基。因此，需要具有改善的性能的α-HL纳米孔。专利技术概述如本文所述，提供了含有氨基酸变异的突变葡萄球菌α溶血素(αHL)多肽，所述氨基酸变异增强穿入时间(timetothread)，例如减少捕获目标分子的时间。例如，公开的变体减少目标分子(例如，各种标记的核苷酸或待测序的核苷酸)的穿入时间。在某些实例方面，α-溶血素(α-HL)变体在对应于SEQIDNO:14(成熟的野生型α溶血素序列)的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合中的任一个的位置处包含取代。α-溶血素的取代也可以是正电荷。α-溶血素变体还可以包括SEQIDNO:14的H144A处的取代。在某些方面，α-溶血素变体还可以包括SEQIDNO:14的残基127-131处的一个或多个甘氨酸残基，诸如跨越SEQIDNO:14的残基127至131的整个长度的一系列甘氨酸残基。在某些实例方面，α-溶血素变体包括具有本文所述的取代中的至少一个的氨基酸序列，而α-溶血素变体的序列与如SEQIDNO:14所示的氨基酸序列具有至少80%、90%、95%、98%或更多序列同一性。在某些实例方面，所述α-溶血素变体包括与如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12或SEQIDNO:13所示的氨基酸序列具有至少80%、90%、95%、98%或更多序列同一性的氨基酸序列。在某些实例方面，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的H35G+V149K的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的V149K+E287R+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的V149K+E287R的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的T109K+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的P151K+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的V149K+P151K+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的T109K+V149K+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的V149K+K147N+E111N+127-131G+M113A+H35G的位置处的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQIDNO:14的V149K+K147N+E111N+127-131G+M113A的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于T109K+V149K+P151K+H35G的取代。在某些实例方面，任何这样的组合还可以包括SEQIDNO:14的H144A处的取代。在某些实例方面，本文所述的氨基酸取代允许添加异源分子，诸如聚乙二醇(PEG)。在某些实例方面，a-HL变体具有一个或多个翻译后修饰。在某些实例方面，所述取代是在约5至约8.5的pH下碱性或带正电荷的非天然氨基酸。在某些实例方面，本文所述的α-溶血素变体与DNA聚合酶结合(诸如经由共价键)。例如，α-溶血素变体经由SpyTag/SpyCatcher连接与DNA聚合酶结合。在某些实例方面，α-溶血素变体经由异肽键与DNA聚合酶结合。在某些实例方面，提供了七聚体纳米孔组装体。该组装体例如包括本文所述的α-溶血素变体中的至少一种或多种。例如，七聚体纳米孔组装体可以包括一种或多种α-溶血素分子，其在SEQIDNO:14的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合处具有取代，如本文所述。在某些实例方面，提供了包括突变αHL多肽(M)的异聚体孔组装体，例如，含有野生型(WT)葡萄球菌αHL多肽和突变αHL多肽的孔组装体，其中所述突变αHL多肽的氨基酸变体(如本文所提供)占据孔结构的跨膜通道中的位置。例如，WT和变体αHL多肽的比率由式WT7-nMn表示，其中n是1、2、3、4、5、6或7。在某些方面，异七聚体中的αHL多肽的比率是WT7-nMn。在其它方面，所述比率是WT6M1。本文提供的公开内容还涵盖这样的同聚体孔：其中七聚体的每个亚基是突变的αHL多肽(即，其中n=7)。例如，相对于由天然(野生型)α-溶血素组成的孔复合物，本文所述的纳米孔蛋白组装体可以具有改变的穿入时间(TTT)。例如，与包括天然(野生型)α-溶血素的七聚体纳米孔组装体相比，TTT可以降低，诸如降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。在某些实例方面，还提供了编码本文所述的任何α溶血素变体的核酸。例如，核酸序列可以衍生自金黄色葡萄球菌(SEQIDNO:1)。在某些实例方面，还提供了包括编码本文所述的溶血素变体中的任何一种的任何此类核酸的载体。还提供了用所述载体转化的宿主细胞。在某些实例方面，提供了产生如本文所述的α-溶血素变体的方法。所述方法包括，例如，在合适的条件下在合适的培养基中培养包括所述载体的宿主细胞以产生α-溶血素变体的步骤。然后使用本领域已知的方法从培养物中获得所述变体。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.α‑溶血素(α‑HL)变体，其在对应于SEQ ID NO:14的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合中的任一个的位置处包含氨基酸取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.21 US 62/3257491.α-溶血素(α-HL)变体，其在对应于SEQIDNO:14的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合中的任一个的位置处包含氨基酸取代。2.根据权利要求1所述的α-溶血素变体，其中所述取代包含一个或多个正电荷。3.根据权利要求1或2所述的α-溶血素变体，其中所述变体进一步包含在H144A处的取代。4.根据权利要求1-3中任一项所述的α-溶血素变体，其中所述变体进一步在残基127至131处包含一个或多个甘氨酸残基。5.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述取代是V149K。6.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述取代是E287R。7.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述取代是H35G。8.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述取代是T109K。9.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述取代是P151K。10.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述取代是K147N。11.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述取代是E111N。12.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述取代是M113A。13.根据权利要求5-12中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述变体具有与如SEQIDNO:14所示的序列具有至少80%、90%、95%、98%或更多序列同一性的序列。14.根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体，其中所述变体具有与如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：TK克雷格，M安布罗索，C哈里斯，M迪彼得罗，Y邹，M波特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH