一种基于荧光能量转移的单分子/集群DNA合成测序制造技术

本发明专利技术提供了核苷酸类似物，每个核苷酸类似物包含含有一个或多个福斯特共振能量转移(FRET)受体荧光团的标签；具有一个或多个FRET供体荧光团的核苷酸聚合酶；以及用于单链测序的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种基于荧光能量转移的单分子/集群DNA合成测序在本申请全文中，通过作者和出版年份引用了某些出版物。对这些出版物的完整引用可以在权利要求之前找到。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以更全面地描述本专利技术所涉及的现有技术的状态。
技术介绍
高通量DNA测序对于广泛的基因组研究是必不可少的，例如全基因组测序和宏基因组测序，mRNA和miRNA的表达谱，发现可变剪接和多聚腺苷酸化的转录物，表观遗传事件所涉及的组蛋白和染色质变化，以及鉴定转录因子和RNA结合蛋白的结合位点。对个体人类基因组进行测序是尤其具有吸引力的，其在个性化医疗方面具有潜在的尚未实现的无限前景。鉴于高通量DNA测序对于生物学和人类学研究、农业和医学的重要性日益增长，需要在一方面低成本且快速并且在另一方面具有高灵敏度和准确性的测序技术。合成测序(SBS)推动了许多“下一代”测序技术，使该领域基因组测序成本接近$100000(Fuller等，2009，Hawkins等，2010，Morozova等，2009，和Park2009)。随着核苷酸并入检测方法的进一步改进，SBS可以成为驱动第三代平台的引擎，从而实现“$1000基因组”。目前商业化的新一代测序平台已经在这方面取得了实质性的进展，目前高草图覆盖度下的人类基因组测序的成本远低于$10,000(Fuller等，2009，Hawkins等，2010，Morozova等，2009，和Metzker2010)。表达研究(例如使用转录组测序(RNA-Seq))和表观遗传研究(例如使用甲基化测序(Methyl-Seq)、染色质免疫共沉淀测序(ChlP-Seq))以及许多其他研究也从这些平台中获益匪浅(Ozsolak等，2011，Varley等，2010，和Park2009)。尽管如此，对于大多数实验室和临床应用而言，这些成本仍然过高。所有当前的方法都具有一个或多个附加限制：对基因组富含GC或富含AT的部分的偏好覆盖；无法通过均聚物延伸片段准确地测序；无法直接对RNA测序；试剂成本高；难以测序超过约200个核苷酸导致先前未测序的基因组难以从头组装；由于每次运行时可能的读段的数目的上限而导致通量不足。为了克服这些障碍，许多第三代测序平台已经出现在市场上或正在开发中。所有这些测序平台都存在准确性问题，而且大多数都具有有限的通量。该SBS方法的基础光物理原理基于福斯特共振能量转移(FRET)，其中供体分子的电子激发态的能量通过非辐射偶极-偶极相互作用转移到受体分子。结果，供体分子的发光被猝灭，并且观察到受体分子的荧光。FRET的发生和效率取决于各种参数，例如供体和受体之间的距离(<10nm)以及供体发光光谱和受体吸收光谱之间的光谱重叠(Hung等，1996，Turro等，2010)。在过去，FRET已用于Sanger测序(Ju等，1995)。在当前的应用中，这已扩展到SBS。
技术实现思路
一种确定单链DNA中核苷酸身份的方法，其包括：a)使包含单链DNA的组合物与一种或多种非催化金属离子、核苷酸聚合酶和具有以下结构的核苷酸类似物接触，所述单链DNA具有与其一部分杂交的引物：其中碱基为A、C、G、T或U或它们的类似物，其中X为CH2、NH、CHF或CF2，其中n为0、1、2、3或4，其中受体染料是一个或多个荧光团，其中X防止核苷酸聚合酶水解α磷酸酯和β磷酸酯之间的键，所述接触在下述条件下进行：如果核苷酸类似物的碱基与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，则允许核苷酸聚合酶与单链DNA、引物和所述核苷酸类似物形成三元复合物，其中DNA聚合酶具有连接的、并入的和/或缀合的荧光供体分子，其中供体分子是福斯特共振能量转移(FRET)供体，核苷酸类似物上的受体染料是相应的FRET受体，其中如果核苷酸类似物的碱基不与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，则反复地重复与不同的核苷酸类似物的接触，直至核苷酸类似物与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，从而形成三元复合物，条件是(i)每种核苷酸类似物上的碱基类型不同于每种其他核苷酸类似物上的碱基类型，和(ii)每种核苷酸类似物荧光团的受体染料具有预定的荧光波长发射；b)使用适当的光谱发射激发DNA聚合酶供体荧光分子，从而使相应的FRET受体产生预定的荧光波长发射，由此确定核苷酸类似物的身份，所述相应的FRET受体是与所述三元复合物中的核苷酸类似物连接的受体染料有机荧光团。本专利技术还提供了一种确定单链DNA的核苷酸序列的方法，其包括：a)使单链DNA与非催化金属离子、DNA聚合酶和具有以下结构的核苷酸类似物接触，其中所述单链DNA具有与其一部分杂交的引物：其中碱基为A、G、C、T或U、或它们的类似物，其中n为0、1、2、3或4，其中受体染料是一个或多个有机荧光团，其中R'是与封闭部分结合的可切割接头，其中切割该接头产生3'-OH，所述接触在下述条件下进行：允许DNA聚合酶与单链DNA、引物和核苷酸类似物形成三元复合物，其中所述核苷酸类似物的碱基与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，并且其中核苷酸聚合酶具有连接的或并入的荧光供体分子，其中DNA聚合酶具有连接的、并入的和/或缀合的荧光供体分子，其中供体分子是福斯特共振能量转移(FRET)供体，受体染料和核苷酸类似物上的受体染料是相应的FRET受体；b)使用适当的光谱发射激发DNA聚合酶供体荧光分子，从而使相应的FRET受体产生独特的预定荧光波长发射，从而确定核苷酸类似物的身份，所述相应的FRET受体为与三元复合物中的核苷酸类似物连接的受体染料有机荧光团；c)在允许DNA聚合酶将核苷酸类似物并入引物中的条件下，使三元复合物与催化金属离子接触；d)切割与并入的类似物的封闭部分结合的接头，从而产生3'-OH；e)对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。本专利技术还提供了用于确定单链DNA的核苷酸序列的实时方法，其包括：a)使包含单链DNA的组合物，与核苷酸聚合酶和具有以下结构的四种核苷酸类似物接触，所述单链DNA具有与其一部分杂交的引物：其中碱基是A、G、C、T或U、或它们的类似物，其中n是0、1、2、3或4，其中受体染料是一个或多个荧光团，所述接触在下述条件下进行：当核苷酸类似物的碱基与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补时，则允许核苷酸聚合酶将该核苷酸类似物并入，其中所述核苷酸聚合酶具有连接的或并入的荧光供体分子，其中核苷酸聚合酶具有连接的、并入的和/或缀合的荧光供体分子，其中供体分子是福斯特共振能量转移(FRET)供体，受体染料和核苷酸类似物上的受体染料是相应的FRET受体；b)使用适当的光谱发射激发核苷酸聚合酶荧光供体分子，从而使连接到核苷酸类似物的相应FRET受体，产生独特的预定荧光波长发射，由此确定核苷酸类似物的身份；c)对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有以下结构的核苷酸类似物：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.04 US 62/317,8101.一种具有以下结构的核苷酸类似物：其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或它们的衍生物，其中X是CH2、NH、CHF或CF2，其中n是0、1、2、3或4，其中受体染料是荧光团，其中R'是H或与封闭基团结合的可切割接头。2.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中所述受体染料是2个或3个荧光团。3.根据权利要求1或2中任一项所述的核苷酸类似物，其中所述荧光团是花青染料、罗丹明染料、荧光素、吖啶、香豆素、德克萨斯红染料、BODIPY、GFP、rhodol、ROX、resorfuin、AlexaFlour、TokyoGreen、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明，或多种前述物质。4.根据权利要求1-3中任一项所述的核苷酸类似物，其中所述可切割接头是可光切割的或可化学切割的。5.根据权利要求1-4中任一项所述的核苷酸类似物，其中所述可切割接头是烯丙基、烷基、羰基、Sieber接头、吲哚、二硫化物、二硫代甲基、叠氮甲基或硝基苄基。6.一种确定单链DNA中的核苷酸的身份的方法，其包括：a)使包含具有与其一部分杂交的引物的单链DNA的组合物与核苷酸聚合酶和具有以下结构的核苷酸类似物接触：其中碱基为A、C、G、T或U或它们的类似物，其中X为CH2、NH、CHF或CF2，其中n为0、1、2、3或4，其中受体染料是一个或多个荧光团，其中X防止核苷酸聚合酶水解α磷酸酯和β磷酸酯之间的键，所述接触在下述条件下进行：如果核苷酸类似物的碱基与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷残基杂交的核苷酸残基的核苷酸残基互补，则允许核苷酸聚合酶与单链DNA、引物和所述核苷酸类似物形成三元复合物，其中DNA聚合酶具有连接的、并入的和/或缀合的荧光供体分子，其中供体分子是福斯特共振能量转移(FRET)供体，核苷酸类似物上的受体染料是相应的FRET受体，其中如果核苷酸类似物的碱基不与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，则反复地重复与不同的核苷酸类似物接触，直至核苷酸类似物与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，从而形成三元复合物，条件是(i)每种核苷酸类似物上的碱基类型不同于每种其他核苷酸类似物上的碱基类型，和(ii)每种核苷酸类似物荧光团的受体染料具有预定的荧光波长发射；b)使用适当的光谱发射激发DNA聚合酶供体荧光分子，从而使相应的FRET受体产生预定的荧光波长发射，从而确定核苷酸类似物的身份，其中所述相应的FRET受体是与所述三元复合物中的核苷酸类似物连接的受体染料有机荧光团。7.一种确定单链DNA的核苷酸序列的方法，其包括：a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA，与核苷酸聚合酶和具有以下结构的核苷酸类似物接触：其中碱基为A、G、C、T或U、或它们的类似物，其中X为CH2、NH、CHF或CF2，其中n为0、1、2、3或4，其中受体染料为荧光团，其中X防止核苷酸聚合酶水解α磷酸酯和β磷酸酯之间的键，其中核苷酸聚合酶具有连接的、并入的和/或缀合的荧光供体分子，其中所述供体分子是福斯特共振能量转移(FRET)供体，核苷酸类似物上的受体染料是相应的FRET受体，所述接触在下述条件下进行：如果核苷酸类似物的碱基与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，则允许DNA聚合酶与单链DNA、引物和所述核苷酸类似物形成三元复合物，如果核苷酸类似物的碱基不与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，则反复地重复与不同的核苷酸类似物的接触，直至类似物与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，从而形成三元复合物，条件是(i)每种核苷酸类似物上的碱基类型不同于每种其他核苷酸类似物上的碱基类型，和(ii)每种核苷酸类似物的荧光团具有预定的荧光波长发射；b)使用适当的光谱发射激发核苷酸聚合酶供体荧光分子，从而使相应的FRET受体产生预定的荧光波长发射，从而确定核苷酸类似物的身份，其中所述受体为与三元复合物中的核苷酸类似物连接的受体染料有机荧光团；c)在允许核苷酸聚合酶将与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的核苷酸残基互补的3'-O封闭的核苷酸可逆终止子催化并入至引物中的条件下，使所述三元复合物与3'-O封闭的核苷酸可逆终止子接触，从而取代所述三元复合物中的核苷酸类似物，其中3'-O封闭的核苷酸可逆终止子具有以下结构：其中R'是与封闭部分结合的可切割接头，其中切割所述接头产生3'-OH；d)切割与并入的3'-O封闭的核苷酸可逆终止子的封闭部分结合的接头，从而产生3'-OH；e)对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。8.一种确定单链DNA的核苷酸序列的方法，其包括：a)使包含具有与其一部分杂交的引物的单链DNA的组合物与核苷酸聚合酶和具有以下结构的四种核苷酸类似物接触：其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或它们的类似物，其中n是0、1、2、3或4，其中受体染料是一个或多个荧光团，其中X防止核苷酸聚合酶水解α磷酸酯和β磷酸酯之间的键，其中核苷酸聚合酶具有连接的、并入的和/或缀合的荧光供体分子，其中所述供体分子是福斯特共振能量转移(FRET)供体，核苷酸类似物上的受体染料是相应的FRET受体，其中(i)每种类似物上的碱基类型不同于其它三种类似物中每一种类似物上的碱基类型，(ii)每种核苷酸类似物的荧光团具有对应于碱基类型的独特的预定荧光波长发射，(iii)每种类似物的荧光团是FRET受体，所述FRET受体被核苷酸聚合酶中的相同供体荧光分子激发；所述接触在下述条件下进行：允许核苷酸聚合酶与单链DNA、引物和核苷酸类似物形成三元复合物，其中所述核苷酸类似物的碱基与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的核苷酸残基互补，b)使用适当的光谱发射激发核苷酸聚合酶供体荧光分子，从而使相应的FRET受体产生独特的预定荧光波长发射，从而确定核苷酸类似物的身份，其中所述相应的FRET受体为与所述三元复合物中的核苷酸类似物连接的受体染料荧光团；c)在允许核苷酸聚合酶将与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基的核苷酸残基互补的3'-O封闭的核苷酸可逆终止子催化并入至引物中的条件下，使所述三元复合物与3'-O封闭的核苷酸可逆终止子接触，从而取代所述三元复合物中的核苷酸类似物，其中3'-O封闭的核苷酸可逆终止子具有以下结构：其中R'是与封闭部分结合的可切割接头，其中切割所述接头产生3'-OH；d)切割与并入的3'-O封闭的核苷酸可逆终止子的封闭部分结合的接头，从而产生3'-OH；e)对待测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至d)，从而确定单链DNA的序列。9.根据权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述可切割接头是可光切割的或可化学切割的。10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述可切割接头是烯丙基、烷基、羰基、Sieber接头、吲哚、二硫化物、二硫代甲基、叠氮甲基、硝基苄基中的任何一种。11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中使用Pd(0)、四丁基铵、DTT、三膦、过氧二硫酸盐、碘、或它们的任何衍生物切割所述可切割接头。12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中任选地在步骤a)至d)的中的每一个步骤之后进行缓冲液洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：静岳·具，希夫·库马尔，詹姆士·J·鲁索，斯蒂芬·卓库兹，李增民，李晓旭，谢尔盖·M·卡拉什尼科夫，易瑞娜·莫罗佐娃，
申请(专利权)人：纽约哥伦比亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US