引物组合在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及引物组合在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用。该引物组合特异性强，且能准确鉴定样品中鸭或鸭肉。使用LAMP技术在实时荧光PCR仪中实时检测生肉、肉类加工食品等以肉为主的样品中的鸭肉核酸DNA。本发明专利技术筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它PCR方法具有更高的特异性，比现有的同类方法具有更快的检测速度。本发明专利技术提供的检测鸡肉的LAMP引物，在总反应时间50min内即能检测到20fg的核酸，且使用荧光法LAMP进行检测，可以实时观察结果，避免了造成污染的风险。

【技术实现步骤摘要】
引物组合在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及引物组合在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用。
技术介绍
肉是我们人类优质蛋白质和多种营养素的主要来源，含有丰富的必须氨基酸和多种微量元素。近年来，随着我国居民生活水平的提高，仅国内生产的肉类远不能满足市场需求，需要从国外进口部分肉类。这些因素为国内外不法商贩乘虚而入创造了条件，在市场上肉的掺假和欺诈行为也越来越受到人们的关注。鸭肉虽然是一种对身体很健康的肉类，但同时，鸭肉也常常被用作掺假肉来冒羊肉、牛肉等价格昂贵的肉类，且这种情况比比皆是。所以，为了保障消费者合法权益，确立有效的肉源性成份鉴定方法是十分必要。对于现今社会而言，传统的依靠感官和经验的肉类形态鉴别方法已经不能满足市场对肉制品掺假现象进行控制监管的需要。目前对肉类产品的鉴定方法主要在蛋白质和核酸水平进行。在蛋白质水平，常用ELISA和高效液相色谱等技术进行检测，其局限性在于对仪器、试剂和样品处理要求高，且检测加工样品时特异性和准确性较差，费时费力。相对来说，检测核酸的方式更方便准确。在核酸水平，常用的核酸水平检测技术有PCR与实时荧光PCR。PCR技术是目前最常用的检测肉源性成分的方法，因为其具有较高的灵敏度、特异性和可操作性。但一般的PCR反应至少1.5h，且后期检测需要使用基因测序和凝胶电泳，而凝胶电泳中的EB具有强致癌性，具有一定的安全隐患。而实时荧光PCR需要昂贵的仪器及试剂，且反应时间至少1.5h，且对操作人员有较高要求，难以在基层得以推广。现有技术公开了一种检测鸡肉的LAMP引物，该引物在总反应时间60min内检测出的极限为50fg的核酸，其使用的可视化法是在反应结束后，观察反应后的体系是否变浑浊，这种方法虽然简便，但由于个体差异和没有标准的判读范围，很容易在结果判读时造成假阳或假阴的结果误判。另一种可视化方法是在反应后开盖加入染料使其显色，这个过程中极其容易造成产物污染，导致其他检测指标出现假阳性现象。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种特异性强，且能准确鉴定样品中鸭肉的LAMP引物及检测方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了线粒体Cytb基因在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用。此外，本专利技术还提供了一种标志物，具有如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。在此基础上，本专利技术还提供了具有如SEQIDNO:7所示序列的核苷酸作为标志物在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了引物组合，包括：引物-F3、引物-B3、引物-FIP、引物-BIP、引物-LF和引物-LB；所述引物-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(I)、具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(II)、具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(III)、与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(IV)、如(I)、(II)或(III)所示序列的互补序列；所述引物-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(V)、具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；(VI)、具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(VII)、与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(VIII)、如(V)、(VI)或(VII)所示序列的互补序列；所述引物-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(IX)、具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；(X)、具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(XI)、与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(XII)、如(IX)、(X)或(XI)所示序列的互补序列；所述引物-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(XIII)、具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；(XIV)、具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(XV)、与SEQIDNO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(XVI)、如(XIII)、(XIV)或(XV)所示序列的互补序列；所述引物-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(XVII)、具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；(XVIII)、具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(XIX)、与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(XX)、如(XVII)、(XVIII)或(XIX)所示序列的互补序列；所述引物-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(XXI)、具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；(XXII)、具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(XXIII)、与SEQIDNO:6所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(XXIV)、如(XXI)、(XXII)或(XXIII)所示序列的互补序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组合中所述引物-F3、所述引物-B3、所述引物-FIP、所述引物-BIP、所述引物-LF和所述引物-LB的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。本专利技术还提供了一种试剂盒，包括所述的引物组合。本专利技术还提供了所述的引物组合或所述的试剂盒在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了鸭的种属鉴定的方法，包括如下步骤：(1)获得待测样品的核酸；(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，分别采用如权利要求4或5所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；(3)根据所述扩增结果获得鉴定结果：如果可以实现特异性扩增，则待测样品为鸭；如果不能实现特异性扩增，则待测样品不为鸭。此外，本专利技术还提供了鸭肉的鉴定的方法，包括如下步骤：(1)获得待测样品的核酸；(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，分别采用如权利要求4或5所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；(3)根据所述扩增结果获得鉴定结果：如果可以实现特异性扩增，则待测样品为鸭肉；如果不能实现特异性扩增，则待测样品不为鸭肉。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述环介导等温扩增的反应体系为：0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；1μL的待测样品核酸，加水至20μL体系。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述环介导等温扩增的反应温度为60℃～65℃，反应时间为50min。本专利技术提供了一种特异性强，且能准确鉴定样品中鸭肉的LAMP引物组和应用方法。使用LAMP技术在实时荧光PCR仪中实时检测生肉、肉类加工食品等以肉为主的样品中的鸭肉核酸DNA。本专利技术筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它PCR方法具有更高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.线粒体Cytb基因在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用。

【技术特征摘要】
1.线粒体Cytb基因在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用。2.标志物，其特征在于，具有如SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。3.具有如SEQIDNO:7所示序列的核苷酸作为标志物在鸭的种属鉴定和/或鸭肉鉴定中的应用。4.引物组合，其特征在于，包括：引物-F3、引物-B3、引物-FIP、引物-BIP、引物-LF和引物-LB；所述引物-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(I)、具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(II)、具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(III)、与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(IV)、如(I)、(II)或(III)所示序列的互补序列；所述引物-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(V)、具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；(VI)、具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(VII)、与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(VIII)、如(V)、(VI)或(VII)所示序列的互补序列；所述引物-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(IX)、具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；(X)、具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(XI)、与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(XII)、如(IX)、(X)或(XI)所示序列的互补序列；所述引物-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(XIII)、具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；(XIV)、具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；(XV)、与SEQIDNO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；(XVI)、如(XIII)、(XIV)或(XV)所示序列的互补序列；所述引物-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：(XVII)、具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；(XVIII)、具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列经修饰、取代...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，陈燕旌，邢婉丽，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11