微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂及制备方法技术

本发明专利技术涉及核磁共振造影剂，具体涉及微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂及制备方法，属于生物医用材料领域。向微管蛋白中加入氯化钆，微管蛋白的浓度为2mg/ml，氯化钆的加入量应使得即氯化钆终浓度为1mM，采用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节体系的PH值至7.5，置于摇床内振荡后取出，使用超滤管超滤，使得微管蛋白与钆离子组装成钆@微管蛋白(Gd@Tubulin)纳米体系。本发明专利技术制备的微管蛋白自组装钆基纳米颗粒具有制备简单，安全性高，体内循环时间长等优点，且成功应用于体内磁共振成像。本发明专利技术合成的新型微管蛋白自组装钆基纳米颗粒作为磁共振造影剂将在生物医学基础研究领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂及制备方法
本专利技术涉及一种新型核磁共振纳米造影及其制备方法，具体涉及微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂及制备方法，属于生物医用材料领域。
技术介绍
核磁共振成像(Magneticresonanceimaging，MRI)因其高软组织对比分辨力、多方位成像、多参数成像、非侵入式和无辐射损害等优势，而成为临床疾病诊疗上的重要辅助手段。在临床MRI诊断过程中，为了进一步增加病变组织与正常组织的信号差别，让病灶“暴露无遗”，往往需要磁共振成像造影剂(contrastagents，CA)来更好地反应病变组织的实际大小、程度及病变特征。目前临床上常用的磁共振造影剂为小分子钆类顺磁性阳性造影剂，以Gd-DTPA(马根维显；钆喷酸葡胺)为代表，通过缩短纵向弛豫时间(T1),使得核磁信号增高。但这类小分子造影剂也存在弛豫率较低、成像窗口窄(易代谢；体内循环时间短)和潜在肾毒性等不足，影响其临床应用。因此，迫切需要开发出一种新型的生物安全性高、体内循环时间长的新型核磁造影剂。天然状态下，二价钙离子能够可逆结合至微管蛋白二聚体，有研究表明钆离子具有更强的结合能力[ClaudioSoto,PatricioH,guez,andOctavioMonasterio.CalciumandGado-liniumIonsStimulatetheGTPaseActivityofPurifiedChickenBrainTubulinthroughaConformationalChange.Biochemistry1996,35,6337-6344]，可替换钙离子，占据其位点。在碱性条件下，微管蛋白带负电荷，而钆离子带正电荷，二者还可通过电荷作用相结合。钆离子和大分子微管蛋白结合后，对血液钙离子浓度和体内的电平衡无影响。基于此特性，本专利技术试图首次通过微管蛋白单体体外自组装形成纳米颗粒后，整合顺磁性物质钆元素，制备新型纳米核磁造影剂。该纳米核磁造影剂具有体内的循环时间长，成像窗口宽等特性。并且本实验所使用的微管蛋白提取自动物脑组织，为天然的生物材料，在生物相容性方面有较大优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种生物安全性高、体内循环时间长的MR造影剂及其制备方法。该造影剂主要由微管蛋白(tubulin)和钆元素组成，其中主要起造影作用的是结合于微管蛋白的钆离子，另外这种强结合避免了钆离子泄露，提高了该造影剂的生物相容性。另外，该造影剂的骨架结构由微管蛋白自组装形成，粒径可控，显著延长了该造影剂在体内的循环时间。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：通过聚合-解聚的周期作用从新鲜猪脑中分离微管蛋白，并对分离出的微管蛋白纯度进行变性凝胶电泳分析。向微管蛋白中加入氯化钆，微管蛋白的浓度为2mg/ml，氯化钆的加入量应使得即氯化钆终浓度为1mM，采用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节体系的PH值至7.5，置于摇床内振荡后取出，使用超滤管超滤，使得微管蛋白与钆离子组装成钆@微管蛋白(Gd@Tubulin)纳米体系。所述氢氧化钠溶液的浓度为10mM。所述摇床内振荡的时间为37℃，转速为80rpm，振荡时间为4h。所述超滤管为30kDa的超滤管；超滤次数为3次，每次向超滤管上管中加入0.5×缓冲液A，使总液体体积为3ml，每次超滤条件为37℃，3500rpm，1h。本专利技术的优点是提供了一种生物相容性较高的MR造影剂及其制备方法，解决了小分子钆基造影剂因离子交换导致的钆离子泄露的毒性问题和体内滞留时间短等问题，具有较好的临床的应用潜能。同时，该造影剂制备简单，便于大规模产业化制备。附图说明图1为样品的MRIT1加权相对信号值与反应时间的关系。横坐标为样品浓度，纵坐标为磁共振T1加权信号相对增长率。图2为样品的MRIT1加权相对信号值与氯化钆浓度的关系。横坐标为样品浓度，纵坐标为磁共振T1加权信号相对增长率。图3为样品的MRIT1加权相对信号值与PH值的关系。横坐标为样品浓度，纵坐标为磁共振T1加权信号相对增长率。图4为样品的MRIT1加权相对信号值与样品钆@微管蛋白浓度的关系。横坐标为样品钆@微管蛋白浓度，纵坐标为磁共振T1加权信号相对增长率。图5为Tubulin和Gd@Tubulin的透射电镜扫描图。图6为Tubulin和Gd@Tubulin的粒径分布图。图7为Gd@Tubulin在小鼠体内的MRI成像。图8为Gd@Tubulin在小鼠体内的毒性检测。具体实施方式主要试剂：反应中所用的溶剂皆为分析纯，所用试剂未加特殊说明直接应用而未经任何特殊处理；吗啉乙磺酸(MES，粉末，质量百分比≥99.5％)，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA，粉末，质量百分比≥99.0％),氯化镁(粉末，质量百分比≥99.0％)，胃蛋白酶抑制剂(pepstatin，粉末，≥质量百分比75％)，亮抑酶肽(leupeptin，粉末，质量百分比≥90％)，鸟苷-5'-三磷酸二钠盐(GTP)，氯化钆购于美国阿拉丁工业公司，1×磷酸盐缓冲液购于美国Hyclone公司，抑肽酶(aprotinin，Biosharp)，丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF，aMRESCO)，二甲基亚砜(DMSO)，甘油，蔗糖，氯化钠，氯化钾，十二水磷酸氢二钠和磷酸二氢钾购于国药集团化学试剂有限公司。主要仪器：超高速离心机(BeckmanL-90K)，高速离心机(BeckmanJ-30I)，摆桶式离心机(BeckmanX-12R)，超滤管(Millipore，分子量为30kDa),teflon-glass匀质仪,研钵，透射电镜(美国FEI公司，Tecnai12)，粒径分析仪(MalvernZetaSizerNanoS90)集热式恒温磁力加热搅拌器是(LICHENDF-101S)，摇床(KYC100B)等。微管蛋白的提取过程如下：准备新鲜猪脑。1解聚:去除猪脑表面的网膜及周围血管，用预冷的1×磷酸盐缓冲液洗净，称重，每1g猪脑组织加入1mL等渗缓冲液(0.32M蔗糖,1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸,1mM氯化镁,10mM磷酸盐缓冲液,pH值为7)，加入丝氨酸蛋白酶抑制剂使该抑制剂终浓度为1mM，加入抑肽酶，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂使这三种试剂的终浓度均为1μΜ，先用厨用搅拌机搅拌充分，然后用teflon-glass匀质仪充分研磨，以上过程保持在冰上进行。用Beckman高速离心机在离心力为25000×g，温度为4℃的条件下离心30min，取上清；2聚合：测量步骤1的上清总体积，每9个体积的上清中加入1个体积的10×缓冲液A(1M吗啉乙磺酸,20mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸,10mM磷酸缓冲液,pH值为6.7)，加入2.5个体积的甘油，加入丝氨酸蛋白酶抑制剂(100mM)和鸟苷-5'-三磷酸二钠盐(1M)使这两种试剂的终浓度均为1mM，将混合液放入集热式恒温磁力加热搅拌器中，设置温度为37℃，以转速600rpm搅拌。3.5h后取出混合液，用Beckman超高速离心机在离心力为100000×g，温度为37℃的条件下离心1.5h，取沉淀。3解聚：用预冷的1×缓冲液A重悬步骤2沉淀(10～20mg/ml)，将重悬液放入集热式恒温磁力加热搅拌器中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，向微管蛋白中加入氯化钆，微管蛋白的浓度为2mg/ml，氯化钆的加入量应使得即氯化钆终浓度为1mM，采用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节体系的PH值至7.5，置于摇床内振荡后取出，使用超滤管超滤，使得微管蛋白与钆离子组装成钆@微管蛋白纳米体系，得到微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂。

【技术特征摘要】
1.微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，向微管蛋白中加入氯化钆，微管蛋白的浓度为2mg/ml，氯化钆的加入量应使得即氯化钆终浓度为1mM，采用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节体系的PH值至7.5，置于摇床内振荡后取出，使用超滤管超滤，使得微管蛋白与钆离子组装成钆@微管蛋白纳米体系，得到微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂。2.如权利要求1所述的微管蛋白自组装钆纳米核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张礼荣，陈懂燕，朱海涛，王冬青，龚爱华，杜凤移，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32