双发射比色荧光纳米微球制备方法及其细菌检测的应用技术

双发射比色荧光纳米微球制备方法及其细菌检测的应用属于比色传感技术领域。本发明专利技术采用组装方法原位制备SiO2负载蓝色荧光碳点(CDs)和红色荧光Cu NCs的纳米微球，其在380nm紫外光激发下，呈现可见光区450nm的蓝色和650nm的红色双发射荧光效果。其具有对pH值特异性响应效果，随着pH值从4.0变化到7.2，纳米微球的红色荧光逐渐减弱，同时蓝色荧光保持不变，这样可以通过复合光的颜色变化，可视化比色检测pH值的变化。该双荧光发射纳米微球探针可以用于检测细菌代谢体系的pH，从而获得细菌的繁殖量，还能以较高的信噪比对细菌进行生物荧光成像。该微球通过简单的离心操作从检测体系中分离，可以降低探针材料对环境的污染。

【技术实现步骤摘要】
双发射比色荧光纳米微球制备方法及其细菌检测的应用
本专利技术属于比色传感
，具体涉及一种具有pH响应的的双发射比色荧光纳米微球探针的制备及其在细菌代谢检测及成像领域的应用。
技术介绍
细菌在我们的日常生活中无处不在。虽然有一些对人类有益，如乳酸菌和链霉菌，但大多数细菌的危害大于益处，特别是在食物储存、生命安全和身体健康方面。世界各地被浪费掉的食物有20％是由于细菌造成的，这不仅会造成食物浪费和经济损失，还会造成环境污染。同时，各种细菌的繁殖会引起多种疾病甚至危及生命。大肠杆菌(E.coli)是最常见的临床病原体之一，可引起一系列威胁生命的疾病(例如败血症和溶血性尿毒症综合症)并且造成巨大的医疗，经济负担。为了最大限度地减少细菌的危害，细菌繁殖和代谢的早期检测至关重要。由于细菌代谢会产生大量的乳酸和碳酸，这将会使细菌生长环境的pH值降低。因此，通过监测细菌周围环境的pH变化，可以检测细菌的生长和代谢，进而尽快采取措施来抑制细菌生长。荧光探针由于其高选择性、高灵敏度、方便和快捷操作的优点而被广泛用于pH检测，常用的荧光探针主要包括有机染料、半导体量子点(QDs)和金属纳米簇(NCs)等，考虑到有机染料和半导体量子点的毒性，荧光金属纳米簇用作pH荧光探针具有重要实用价值。金属纳米簇是由数十至数百个原子组成，其尺寸接近1-2nm，由金属核和外部的有机稳定剂共同组成。由于其超小的尺寸接近电子的费米能级，使得它具有独特的光学和物理学特性，所以引起了研究人员的广泛关注；由于其荧光强、毒性低、生物相容性好和制备方法简单等优点，它可以广泛应用于离子检测、生物传感、医学成像和催化等领域。其中，CuNCs由于其独特的光学性质及其廉价于金和铂等贵金属的优点而受到科研工作人员的关注；此外，CuNCs的荧光具有环境响应的特性，即在一定条件下，例如溶剂、离子、pH和特殊物质等的影响下，材料呈现明显的荧光强度的变化。因此，它可以用于离子检测和生物检测领域。然而，大多数基于CuNCs的探针普遍存在于水体系中，因此不易回收，无法重复利用，这不但导致试剂浪费并且会导致环境污染。为此亟需制备易分离的CuNCs探针。SiO2纳米微球由于其优异的化学和光稳定性、良好的透光性和突出的生物相容性、易于分离提纯等优点，因而具有很大的应用前景。不但如此，这些荧光检测装置大部分是基于单发射检测的，这意味着许多因素包括探针浓度、仪器灵敏度和环境条件都会影响检测的结果。相比之下，双发射荧光材料在单激发状态下显示出两个不同的发射峰，这意味着对其自身的内置校正因子，可以用作比色荧光探针来校准误差，避免数据失真。因此，制备具有校准因子的基于CuNCs的双发射硅球探针具有重要的实际意义。基于以上的背景研究，我们通过自组装方法原位合成了具有蓝色荧光和红色荧光的双发射且易于分离的CuNCs-SiO2@CDs荧光探针。我们首先合成了包覆蓝色荧光CDs的硅球，然后通过修饰红色荧光CuNCs，获得双荧光发射纳米材料，其对于pH具有特殊敏感性，当pH值从4.0-7.2逐渐升高每变化0.2个单位时，纳米材料的荧光会呈现由红色到蓝色的颜色变化，可以实现通过比色法可视化检测pH值，并且检测过程非常简单便捷。进一步地，我们将双发射比色探针用于细菌代谢体系的检测，可以快速的检测细菌代谢体系的pH值，并间接反应细菌的繁殖量，而且还能以较高的信噪比对细菌进行荧光成像。因此，我们所构筑的双发射比色荧光纳米微球探针可以为细菌检测、抗菌灭菌和生物成像等领域提供新的检测方法。
技术实现思路
本专利技术涉及一种基于铜纳米簇具有pH响应的的双发射比色荧光纳米微球探针的制备及其在细菌代谢检测及成像领域的应用。该探针具有结构稳定，容易分离，操作方便，环境友好等特点。本专利技术所述的用于细菌代谢检测及成像的新型CuNCs基双荧光发射探针的制备方法，其步骤如下：(1)、蓝色荧光碳点(CDs)具体合成方法如下：将碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、壳聚糖、乳酸、柠檬酸、纤维素、苯酚、间苯二胺、对苯二甲酸、三聚氰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚乙烯基亚胺和柚子皮等)和氮源(组氨酸、色氨酸、甘氨酸，精氨酸，半胱氨酸、谷胱甘肽、尿素、氨基脲、二苯胺基脲、乙二胺和三乙烯四胺等)按摩尔比为1～10:1溶解在碳源质量8～15倍的去离子水中。然后将混合溶液加入到特氟龙反应釜中，加热到60～300℃反应2～10h，反应结束后，自然冷却至室温。获得的产品为棕黑色透明溶液，然后通过渗析处理，除去未反应的小分子，最终得到碳量子点黄色水溶液，冷冻干燥后得到纯化的淡黄色CDs粉末，将其分散在去离子水中制备浓度为10mg/mL的CDs溶液，并在4℃下避光储存备用。(2)、蓝色荧光SiO2@CDs的制备：首先，将步骤(1)得到的CDs溶液5-30mL加入到1000mL反应烧瓶中，加入1-10mL原硅酸四乙酯(TEOS)，5-15mL弱碱(氨水、乙二胺和三乙胺等)和100-300mL醇(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇等)混合均匀，通入氮气，混合溶液进行机械搅拌1-3h，然后用恒压滴液漏斗(D/3s)缓慢滴加含有2-15mLTEOS和3-10mL乙醇的混合溶液。滴加完后，继续搅拌10-50h，然后用HCl水溶液将体系的pH调节至3-6，结束反应。离心得到固体后分别用水和乙醇洗涤，在1000-8000rpm离心2-10min，固体物质干燥即获得SiO2@CDs纳米微球粉末，纳米微球粒径可以是100-1000nm，尺寸均匀。将其配置成10-50mg/mL不同浓度的溶液避光低温保存备用。(3)、红色荧光CuNCs的制备：在剧烈搅拌下，将100mM的铜源(碱式碳酸铜Cu2(OH)2CO3、碱式硫酸铜Cu2(OH)2SO4、氯化铜CuCl2、硫酸铜CuSO4、硝酸铜Cu(NO3)2和醋酸铜Cu(Ac)2等)，用去离子水制备成水溶液(20-60μL)，加入含有5-30mM的青霉胺(DPA)的水溶液(2-10mL)，通入氮气搅拌反应5-20min，产生浅黄色悬浊溶液，离心得到固体用去离子水洗涤3次，产物即为CuNCs，其在UV紫外灯照射下显示红色荧光。将其配置成10mg/mL的溶液避光低温保存备用。(4)、双荧光发射CuNCs-SiO2@CDs的合成：将步骤3制备的CuNCs溶液，加入步骤2制备的SiO2@CDs溶液(10-50mg/mL，1-5mL)，室温下充分搅拌1-8h。然后在3000-10000rpm转速下离心5-30min，收集沉淀物，用去离子水洗涤三次，将产物配置成20mg/mL的溶液避光低温保存备用。(5)、细菌代谢成像将20-50g营养琼脂培养基加入去离子水(约1-5L)中，在35℃加热下搅拌均匀。将此水溶液在高压灭菌器中于90-140℃灭菌10-30min，然后将溶液用去离子水稀释2-5倍后分成50份备用。将细菌(葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、酵母菌、伤风杆菌和变形杆菌等)松散地铺在血平板上培养过夜，然后在24孔板中将培育好的细菌(100-200cfu/mL)加入上述琼脂培养液，然后在37℃细菌培养箱中培养24h，然后向其中加入步骤4制备的溶液，在37℃培养，并在不同的时间点(0-10h)收集混合溶液，研究不同培养时间下的pH变化，其荧光颜色也不同，并用激本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.双发射比色荧光纳米微球，其特征在于：这是一种基于铜纳米簇的Cu NCs‑SiO2@CDs纳米微球，呈现双荧光发射的功能，在一个激发波长的光照射下，能够发出两个不同波长的荧光发射峰，具有红/蓝双荧光发射的特点；而且两种荧光对于环境变化产生不同响应性，具有pH响应的双发射比色荧光探针，获得智能化的荧光比色变化效果，作为探针非常有利于进行比色检测。

【技术特征摘要】
1.双发射比色荧光纳米微球，其特征在于：这是一种基于铜纳米簇的CuNCs-SiO2@CDs纳米微球，呈现双荧光发射的功能，在一个激发波长的光照射下，能够发出两个不同波长的荧光发射峰，具有红/蓝双荧光发射的特点；而且两种荧光对于环境变化产生不同响应性，具有pH响应的双发射比色荧光探针，获得智能化的荧光比色变化效果，作为探针非常有利于进行比色检测。2.如权利要求1所述的双发射比色荧光纳米微球，其特征在于：该SiO2纳米微球同时负载了蓝色荧光的碳点CDs，和红色荧光铜纳米簇CuNCs，获得双荧光发射纳米材料；其对于pH具有特殊敏感性，当pH值从4.0-7.2逐渐升高每变化0.2个单位时，纳米微球材料的荧光会呈现由红色到蓝色的颜色变化，可以实现通过比色法可视化检测pH值，并且检测过程非常快速便捷；该荧光纳米微球探针具有容易分离，结构稳定，操作方便，环境友好等特点。3.双发射比色荧光纳米微球的制备方法，其特征在于：(1)蓝色荧光碳点(CDs)具体合成方法如下：将碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、壳聚糖、乳酸、柠檬酸、纤维素、苯酚、间苯二胺、对苯二甲酸、三聚氰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚乙烯基亚胺和柚子皮等)和氮源(组氨酸、色氨酸、甘氨酸，精氨酸，半胱氨酸、谷胱甘肽、尿素、氨基脲、二苯胺基脲、乙二胺和三乙烯四胺等)按摩尔比为1～10:1溶解在碳源质量8～15倍的去离子水中；然后将混合溶液加入到特氟龙反应釜中，加热到60～300℃反应2～10h，反应结束后，自然冷却至室温；获得的产品为棕黑色透明溶液，然后通过渗析处理，除去未反应的小分子，最终得到碳量子点黄色水溶液，冷冻干燥后得到纯化的淡黄色CDs粉末，将其分散在去离子水中制备浓度为10mg/mL的CDs溶液，并在4℃下避光储存备用；(2)蓝色荧光SiO2@CDs的制备方法如下：首先，将步骤(1)得到的CDs溶液5-30mL加入到1000mL反应烧瓶中，加入1-10mL原硅酸四乙酯(TEOS)，5-15mL弱碱(氨水、乙二胺和三乙胺等)和100-300mL醇(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇等)混合均匀，通入氮气，混合溶液进行机械搅拌1-3h，然后用恒压滴液漏斗(D/3s)缓慢滴加含有2-15mLTEOS和3-10mL乙醇的混合溶液；滴加完后，继续搅拌10-50h，然后用HCl水溶液将体系的pH调节至3-6，结束反应；离心得到固体后分别用水和乙醇洗涤，在1000-8000rpm离心2-10min，固体物质干燥即获得SiO2@CDs纳米微球粉末，纳米微球粒径可以是100-1000nm，尺寸均匀；将其配置成10-50mg/mL不同浓度的溶液避光低温保存备用；(3)红色荧光CuNCs的制备方法如下：在剧烈搅拌下，将100mM的铜源(碱式碳酸铜Cu2(OH)2CO3、碱式硫酸铜Cu2(OH)2SO4、氯化铜CuCl2、硫酸铜CuSO4、硝酸铜Cu(NO3)2和醋酸铜Cu(Ac)2等)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：林权，宋善良，王传洗，赵月，赵玥琪，刘厚，杨柏，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22