用于硫嘌呤类药物的用药相关基因分型试剂盒和分型方法技术

本发明专利技术属于基因扩增检测的技术领域，具体涉及用于硫嘌呤类药物的用药相关基因分型试剂盒及分型方法，首创性的发现在基因扩增检测中使用纳米二氧化硅，可以显著提高基因扩增的反应效率和反应特异性，为此将其应用到硫嘌呤类药物的用药相关基因分型的检测中，解决了现有技术中硫嘌呤类药物的用药相关基因分型特异性差、检测速度慢，不能满足对大量样本的快速的、特异性高的检测的问题。

Drug-related Genotyping Kit and Method for Thiopurine Drugs

The invention belongs to the technical field of gene amplification detection, and specifically relates to the drug-related gene typing kit and typing method for thiopurine drugs. The pioneering discovery is that the use of nano-silica in gene amplification detection can significantly improve the response efficiency and specificity of gene amplification. Therefore, it is applied to the detection of drug-related gene typing of thiopurine drugs. In the detection, the problems of poor specificity of drug-related gene typing and slow detection speed of thiopurine drugs in the existing technology are solved, which can not meet the needs of rapid and high specificity detection of a large number of samples.

【技术实现步骤摘要】
用于硫嘌呤类药物的用药相关基因分型试剂盒和分型方法
本专利技术属于基因扩增检测的
，具体涉及用于硫嘌呤类药物的用药相关基因分型试剂盒和分型方法。
技术介绍
世界卫生组织研究结果表明，药物安全性问题是住院病人致死的最重要原因之一，甚至居于全部死亡原因的第五位。药物遗传学和基因组学的研究结果表明，药物代谢酶的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)可以决定药物代谢酶的活性，从而影响药物的临床疗效和毒性程度。SNP存在差异的不同个体服用同一种药物时，该药物的临床疗效和毒性程度也存在个体化差异。因此，如何分析和鉴别个体之间药物代谢酶的SNP差异，并利用这种差异来合理地指导临床用药和进行药物组合已经成为日益关注的一个焦点。硫嘌呤类药物，包括硫鸟嘌呤(6-thioguanine，6-TG)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)及其前体药物硫唑嘌呤(Azathioprine，AZA)，于上世纪50年代由G.B.Elion和GH.Hitchings首先发现。6-TG和6-MP用于炎症性肠病(InflammatoryBowelDisease，IBD)稳定期的诱导和维持治疗，同时也是治疗儿童急性淋巴细胞白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia，ALL)最为广泛应用的药物之一。AZA则主要用于自身免疫性疾病(AutoimmuneDisease，AD)及器官移植后排斥反应的治疗。硫嘌呤类药物本身并不具备药物作用活性或只有很低的药物作用活性，它们在体内需经酶催化生成活性代谢产物6-硫鸟苷酸(6-thioguanineNucleotides，6-TGNs)。6-TGNs作为鸟嘌呤核苷的拮抗剂参入脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid，DNA)和核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)分子，通过抑制DNA的转录、复制和RNA的表达而发挥细胞毒作用进而发挥药理作用。硫嘌呤类药物的临床药物疗效和药物不良反应存在明显个体差异，大约67％服用者有效，约15％的服用者无效，另外还有大约17％的服用者会发生非常严重的甚至能危及生命的药物不良反应，如骨髓抑制、肝脏毒副作用、胰腺炎等。近来年，硫嘌呤类药物的药效及其不良反应的个体化差异，已被证实与硫嘌呤类药物途径中相关酶的单核苷酸多态性存在密切联系，因此，开发能够快速、高特异性检测硫嘌呤类药物相关基因多态性的试剂盒，对于合理、个体化、安全地使用硫嘌呤类药物进行治疗具有重要的临床意义。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种能够快速、高特异性实现硫嘌呤类药物的用药相关基因分型试剂盒。为此，本专利技术提供如下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种用于硫嘌呤类药物的用药相关基因分型试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂、基于硫嘌呤类药物的个体化用药相关基因设计的引物和荧光探针，所述核酸扩增试剂包括纳米二氧化硅。可选地，上述的试剂盒，所述纳米二氧化硅的粒径为50～500nm。优选的，所述纳米二氧化硅为球状。可选地，上述的试剂盒，所述纳米二氧化硅是由溶液I和溶液II混合后在100℃-120℃的温度下反应得到；所述溶液I含有体积分数为10-30％的氨水、体积分数为0.5-2％的水和体积分数为68-89.5％的乙醇，所述溶液II含有体积分数为15-30％的正硅酸乙酯和体积分数为70-85％的乙醇。优选的，所述溶液I含有体积分数为20％的氨水、体积分数为1％的水和体积分数为70％的乙醇，所述溶液II含有体积分数为15％的正硅酸乙酯和体积分数为85％的乙醇。进一步可选地，上述的试剂盒，所述氨水是氨含量为25-28wt％的水溶液。可选地，上述的试剂盒，所述核酸扩增试剂中还包括DNA聚合酶、dNTPs、扩增缓冲液和非离子型表面活性剂中的至少一种。可选地，上述的试剂盒，所述核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：Taq酶，100～500mg/L；dNTPs，50～200g/L；Tris-HCl，0.5～2mL/L；MgCl2，10～40g/L；KCl，5～20g/L；(NH4)2SO4，5～40g/L；纳米二氧化硅，20～100g/L；TritonX-100，1～5mL/L。进一步可选地，上述的试剂盒，所述核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：Taq酶，300mg/L；dNTPs，100g/L；Tris-HCl，1mL/L；MgCl2，20g/L；KCl，10g/L；(NH4)2SO4，10g/L；纳米二氧化硅，50g/L；TritonX-100，2mL/L。可选地，上述的试剂盒，所述引物或荧光探针的浓度为100～300mg/L，优选的，200mg/L。可选地，上述的试剂盒，所述引物和荧光探针是基于TPMT基因的rs1142345位点和NUDT15基因的rs116855232位点中的至少一种设计的。可选地，上述的试剂盒，基于TPMT基因的rs1142345位点设计的引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1-2所示，荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3-4所示；基于NUDT15基因的rs116855232位点设计的引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5-6所示，荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO：7-8所示。可选地，上述的试剂盒，还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括红细胞裂解液，所述细胞裂解液包括溶液A和溶液B，所述溶液A为甲酸浓度为1～5mL/L的水溶液，溶液B为含碳酸钠4～8g/L、氯化钠10～20g/L和硫酸钠25～40g/L的水溶液。优选的，上述的试剂盒，所述溶液A为甲酸浓度为1.2mL/L的水溶液，溶液B为含碳酸钠6g/L、氯化钠14.5g/L和硫酸钠31.3g/L的水溶液。可选地，上述的试剂盒，还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括核酸释放液，所述核酸释放液包括蛋白酶K浓度为10～40g/L、RNase浓度为5～20g/L、EDTA浓度为5～20g/L的水溶液。优选的，上述的试剂盒，所述核酸释放液包括蛋白酶K浓度为20g/L、RNaseA浓度为10g/L、EDTA浓度为15g/L的水溶液。第二方面，本专利技术提供了上述的试剂盒在硫嘌呤类药物的个体化用药相关基因分型中的应用。第三方面，本专利技术提供了利用上述的试剂盒进行硫嘌呤类药物的用药相关基因分型的方法，包括如下步骤：S1、向待测血液中加入红细胞裂解液的溶液A，震荡混合，然后再加入红细胞裂解液的溶液B，震荡混合，随后进行离心、弃上清，重悬细胞；重复以上裂解步骤至少一次，得到细胞裂解液；S2、向细胞裂解液中加入核酸释放液，在63-67℃下处理5-10分钟，然后在100-120℃下处理30-60秒，得到核酸样本；S3、以步骤S2中获得的核酸样本为模板，加至核酸扩增试剂、引物和荧光探针的预混液中，进行实时荧光定量PCR检测。可选地，上述的基因分型方法，在S2步骤中，在65℃处理5分钟，然后100℃处理30秒。可选地，上述的基因分型方法，在S3步骤中，实时荧光定量PCR的反应程序为：热启动，95℃保持5分钟；热循环，循环40次，每循环为95℃保持15秒；最后58～62℃保持30秒。本专利技术技术方案，具有如下优点1、本专利技术提供的用于硫嘌呤类药物的用药相关基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于硫嘌呤类药物的用药相关基因分型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂、基于硫嘌呤类药物的个体化用药相关基因设计的引物和荧光探针，所述核酸扩增试剂包括纳米二氧化硅。

【技术特征摘要】
1.一种用于硫嘌呤类药物的用药相关基因分型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂、基于硫嘌呤类药物的个体化用药相关基因设计的引物和荧光探针，所述核酸扩增试剂包括纳米二氧化硅。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米二氧化硅的粒径为50～500nm。优选的，所述纳米二氧化硅为球状。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还包括DNA聚合酶、dNTPs、扩增缓冲液和非离子型表面活性剂中的至少一种。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：Taq酶，100～500mg/L；dNTPs，50～200g/L；Tris-HCl，0.5～2mL/L；MgCl2，10～40g/L；KCl，5～20g/L；(NH4)2SO4，5～40g/L；纳米二氧化硅，20～100g/L；TritonX-100，1～5mL/L。5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引物或荧光探针的浓度为100～300mg/L。优选的，所述引物或荧光探针的浓度为200mg/L。6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和荧光探针是基于TPMT基因的rs1142345位点和NUDT15基因的rs116855232位点中的至少一种设计的。7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，基于TPMT基因的rs1142345位点设计的引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1-2所示，荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3-4所示；基于NU...

【专利技术属性】
技术研发人员：周连群，李金泽，张芷齐，李传宇，姚佳，张威，郭振，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32