检测人样品中蛋白质的方法以及这样的方法的用途技术

提出了用于收集关于对象健康状态之信息的方法，其包括在对象的血清、血浆或血液中定量检测THBS1浓度、游离PSA比例(％fPSA)，优选地包括选自CTSD、OLFM4、ICAM1的至少一种蛋白质的浓度。

Methods for detecting proteins in human samples and the use of such methods

A method for collecting information about the health status of an object is proposed, which includes quantitative detection of THBS1 concentration in the object's serum, plasma or blood, free PSA ratio (% fPSA), preferably including the concentration of at least one protein selected from CTSD, OLFM4, ICAM1.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测人样品中蛋白质的方法以及这样的方法的用途
本专利技术涉及用于测量人样品中、特别是人血清、血浆或血液中蛋白质的方法的领域，并且其还涉及测定和这样的测定的用途，特别是用于风险评估的用途。现有技术测量个人的人样品中的蛋白质是用于对个人的一般状态进行监督和风险评估的强大工具，特别是在关于个人的营养和健康状态时。前列腺癌(prostatecancer，PCa)是男性中最常被诊断出的癌症并且在美国是男性癌症相关死亡的第二大原因。尽管经过十年的研究努力，前列腺癌的诊断和治疗仍然是临床的一大挑战。不幸的是，PCa进展是无症状的，并且由于仅在该疾病的早期阶段才能完全缓解和治愈该疾病，因此提早检测到较快发展且潜在危险的病变对于患者的健康是至关重要的。可用于PCa的最佳非侵入性诊断测试是检测血液中的前列腺特异性抗原(ProstateSpecificAntigen，PSA)并结合直肠指检(digitalrectalexamination，DRE)。PSA是由前列腺的上皮细胞产生的蛋白质。PSA也称为激肽释放酶III、精囊素(seminin)、精囊蛋白酶(semenogelase)、γ-精浆蛋白(γ-seminoprotein)和P-30抗原，并且其是一种在正常男性的血清中以少量存在的34kD糖蛋白且通常在存在PCa的情况下和在其他前列腺病症中升高。测量PSA的血液测试结合DRE是目前可用于PCa的早期检测的最有效测试。高于正常水平的PSA与局部和转移性PCa相关。单独PSA的诊断准确性为仅约60％，并且该方法的主要缺点在于特异性(过多的假阳性病例经历不需要的前列腺活检或手术)。事实上，PSA水平也可以因前列腺感染、刺激、良性前列腺肥大(增大)或增生(BPH)和最近的射精而提高，从而产生假阳性结果。因此，PCa诊断目前因PSA评价的高假阳性率而受到阻碍，其结果可导致大量具有阴性诊断结果的前列腺活检。此外，这些不必要的活检可以有潜在的副作用。最近反对使用PSA广泛筛查男性PCa的建议导致更少的男性筛查PCa，并且更少的早期病例被检测到。因此，尽管基于同时测量多个参数(例如游离PSA和总PSA)的新方法正在成为提高整体诊断准确性的工具，但是仍然缺乏避免假阳性结果和假阴性结果的可靠且非侵入性的诊断/预后方法。血液中的大多数PSA与血清蛋白结合。少量不是蛋白质结合性的，并且被称为游离PSA。在患有前列腺癌的男性中，游离(未结合)PSA与总PSA的比值降低。如果游离PSA与总PSA的比值(％fPSA)小于25％，则癌症的风险提高。该比值越低，PCa的可能性越大。然而，总PSA和游离PSA二者在射精之后都立即增加，在24小时内缓慢恢复到基线水平，并且与PCa无关的其他机制也可以影响游离PSA与总PSA的比值。迫切需要新的诊断工具、理想地非侵入性工具以改善PCa诊断并且减少不必要的活检和过度治疗。从容易获得的样品类型(例如血液)进行更准确的诊断将允许医生和患者对PCa的潜在情况和是否需要前列腺活检作出更可靠的决定。与诊断类似，PCa的治疗和/或预后由于该疾病的异质性而仍然是一大挑战。尽管已经提出了PCa的多种机制，但是缺乏能够对患者进行分级的合适标记并且用于治疗性干预治愈的关键靶蛋白仍然不可获得。在WO2009/138392中提出了一种发现用于前列腺癌的合适诊断系统的方法，其中提出测量已知存在于人血液中的24种蛋白质的列表中的至少两种，并且预期其根据对应患者的健康状态而被下调或上调。已知方法的问题在于其仍然缺乏关于癌症实际存在的灵敏度且特别是特异性，并且缺乏关于避免假阳性结果和假阴性结果的诊断可靠性。另一个问题是相应检测探针的实际可用性，无论是基于抗体的检测还是任何其他类型的检测，使得相应的工具不仅适用于学术目的而且还适用于广泛应用。另一个问题是相应的检测系统应简单并且不需要大量的单独测量。专利技术概述因此，本专利技术的一个目的是提出用于收集关于对象的健康状态的信息，特别是用于检测人样品中、特别是人血清、血浆或血液中蛋白质的新方法；并且其还涉及测定和这样的测定的用途，特别是用于风险评估、特别是与PCa相关的风险评估的用途。开发并且在技术上验证了针对人组织蛋白酶D(cathepsinD，CTSD)、人细胞间黏附分子1(intercellularadhesionmolecule1，ICAM1)、人嗅介蛋白4(olfactomedin4，OLFM4)和人血小板反应蛋白1(thrombospondin1，THBS1)的四种单独免疫测定。预先使用Pten条件敲除小鼠模型通过质谱鉴定这些糖蛋白的小鼠同源物。在临床血清样品中测量人同源物以通过其自身或与PSA值、特别是％fPSA值组合来测试将良性前列腺病症与PCa区别开的能力。作为结果，确定了所要求保护的组合对于克服现有技术方法的上述缺陷是最佳的。更具体地，本专利技术涉及用于收集关于对象的健康状态的信息的方法。所述方法包括定量检测对象的血清、血液或血浆中的特定蛋白质。对象的血清、血液或血浆也可以在从对象取出之后且在进行所述方法之前储存和/或预处理，例如稀释。具体地，所述方法包括测量THBS1浓度以及测量/确定游离PSA比例(％fPSA，以[游离PSA]/[总PSA]给出，并且因此在0至1的数值范围内)。优选地，其还包括测量选自CTSD、OLFM4、ICAM1的至少一种蛋白质的浓度。换言之，在样品中测量/确定至少2种或优选至少3种蛋白质含量用于收集信息。对于THBS1、CTSD、OLFM4和/或ICAM1，直接或间接确定浓度，其通常以ng/ml表示，而对于PSA，通过量化总PSA和游离PSA的浓度(或者可替选地通过量化总PSA和复合PSA的浓度并由此计算游离PSA比例)来确定游离PSA比例，并且用于分析。对于分析，优选地使用在原始样品、因此在原始血清、血液或血浆中的浓度值，并且如果在测量之前存在对原始血清、血液或血浆进行稀释或修饰的步骤，则反算在原始样品中的浓度。出乎意料地，发现与游离PSA比例(％fPSA)组合的THBS1浓度对阳性前列腺活检并且因此PCa具有高指示性。出乎意料地，发现不与总PSA组合但特别地与％fPSA值组合的THBS1允许确定关于相应对象的健康状态的阳性信息。对大组群进行的分析表明，通过经优化的逻辑回归模型，可以发现参数化在接受者操作特征(receiveroperatingcharacteristic，ROC)表示中具有非常大的曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)并且在90％灵敏度下具有特别高的特异性。除此之外，发现，另外系统CTSD、OLFM4、ICAM1中的任一个如果在该组群上单独地以及再与％fPSA比例一起评价和优化的话不能获得大AUC。然而，特别地，如果测量CTSD、OLFM4、ICAM1组中的另一个的话，特别地如果与THBS1一起并且结合％fPSA测量CTSD的话，则可以在90％灵敏度下获得显著的额外特异性。还可以进一步将信息例如关于相应患者的年龄的信息包括到分析中，这样的另外信息例如年龄也可以用作下面给出的式(1)中的另外的参数。通常，所述方法对具有升高的PSA(2.0至10ng/ml)值、优选地还具有阴性DRE和/或增大前列腺(≥35ml)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于收集关于对象健康状态之信息的方法，其包括在所述对象的血清、血浆或血液中定量检测THBS1浓度以及游离PSA比例(％fPSA)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.15 EP 16179607.31.用于收集关于对象健康状态之信息的方法，其包括在所述对象的血清、血浆或血液中定量检测THBS1浓度以及游离PSA比例(％fPSA)。2.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述对象的血清、血浆或血液中定量检测THBS1浓度、游离PSA比例(％fPSA)以及选自CTSD、OLFM4、ICAM1的至少一种蛋白质的浓度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括：如下进行的第一步骤：使所述对象的血清、血浆或血液、优选地在其稀释之后与每种蛋白质的至少一种亲和试剂接触、优选与每种蛋白质的两种亲和试剂接触，并检测在所述各蛋白质与所述至少一种亲和试剂之间是否发生结合，并使用所述各蛋白质之浓度的定量读出，从而允许计算在原始血清、血浆或血液中的各浓度，或在游离PSA的情况下计算其比例；第二步骤：基于在所述第一步骤中确定的所有所述蛋白质浓度以及所述游离PSA比例来计算组合评分值。4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述第二步骤之后，在第三步骤中，基于在所述第二步骤中确定的所述组合评分值来确定所述对象的阳性活检和/或前列腺癌的风险，其中超过所述组合评分值的相应阈值被视为阳性前列腺癌信息和/或视为需要活检。5.根据前述权利要求3或4中任一项所述的方法，其中所述组合评分值使用下式来计算：其中βi是之前通过使用实验数据进行优化来确定的回归系数，β0是截距，并且其中xi是所述原始血清、血浆或血液中所述各蛋白质的测量浓度，并且在游离PSA的情况下是在所述原始血清、血浆或血液中的比例(％fPSA)。6.根据权利要求5所述的方法，其中在所述第一步骤中测量THBS1浓度(以ng/ml表示)，以及游离PSA比例(％fPSA)(以0至1的数值范围表示)，以及优选地还有CTSD浓度(以ng/ml表示)，并且其中优选地，对于在测量THBS1和游离PSA比例(％fPSA)的情况下计算所述组合评分值，所述回归系数选择如下：β0为4.0至5.5或4.5至5.0，优选4.5至5.0或4.7至4.8；βTHBS1为(-0.00012)至(-0.00003)或(-0.00009)至(-0.00003)，优选(-0.00009)至(-0.00004)或(-0.00006)至(-0.00004)；β％fPSA为(-7.5)至(-2.5)，优选(-5.5)至(-5.0)，并且其中还优选地，对于90％灵敏度，所述组合评分值的阈值选择为0.28至0.35、优选0.30至0.34或0.30至0.33；或者其中优选地，对于在测量THBS1、游离PSA比例(％fPSA)以及CTSD的情况下计算所述组合评分值，所述回归系数选择如下：β0为3至4.2或3至3.4，优选3.8至4.0或3.1至3.3；βCTSD为0.003至0.05或0.005至0.05，优选0.004至0.006或0.008至0.012：βTHBS1为(-0.0002)至(-0.00005)或(-0.00009)至(-0.00003)，优选(-0.00012)至(-0.00008)或(-0.00007)至(-0.00006)；β％fPSA为(-7.5)至(-2.5)，优选(-5.2)至(-5.0)或(-5.2)至(-2.5)，并且其中还优选地，对于90％灵敏度，所述组合评分值的阈值选择为0.28至0.40或0.28至0.35、优选0.35至0.37、或0.33至0.34。7.根据权利要求5所述的方法，其中在所述第一步骤中测量THBS1浓度(以ng/ml表示)、游离PSA比例(％fPSA)(以0至1的数值范围表示)，以及OLFM4浓度(以ng/ml表示)，并且其中优选地，对于所述组合评分值的计算，所述回归系数选择如下：β0为4.0至5.2，优选4.4至4.8；βOLFM4为0.001至0.01，优选0.002至0.004；βTHBS1为(-0.00009)至(-0.00002)，优选(-0.00006)至(-0.00004)；β％fPSA为(-7.5)至(-2.5)，优选(-5.9)至(-4.8)，并且其中还优选地，对于90％灵敏度，所述组合评分值的阈值选择为0.27至0.35、优选0.3至0.34，和/或其中在所述第一步骤中测量THBS1浓度(以ng/ml表示)、游离PSA比例(％fPSA)(以0至1的数值范围表示)，以及ICAM1浓度(以ng/ml表示)，并且其中优选地，对于所述组合评分值的计算，所述回归系数选择如下：β0为4.0至5.2，优选4.6至4.9；βICAM1为(-0.002)至(-0.0001)，优选(-0.0010)至(-0.0005)；βTHBS1为(-0.0001)至(-0.00001)，优选(-0.00008)至(-0.00004)；β％fPSA为(-7.5)至(-2.5)，优选(-5.8)至(-4.9)，并且其中还优选地，对于90％灵敏度，所述组合评分值的阈值选择为0.25至0.35、优选0.3至0.33。8.根据权利要求5所述的方法，其中在所述第一步骤中测量THBS1浓度(以ng/ml表示)、游离PSA比例(％fPSA)(以0至1的数值范围表示)，以及OLFM4、ICAM1和CTSD的浓度(在每种情况下均以ng/ml表示)，并且其中优选地，对于所述组合评分值的计算，所述回归系数选择如下：β0为3至3.8，优选3.5至3.6；βOLFM4为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉尔夫·席斯，卡特琳·恩特，阿尔奇比亚德·阿萨纳修，安纳利萨·马卡尼奥，托马斯·施托伊贝尔，
申请(专利权)人：普罗泰奥梅迪克斯公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH