一种高效降解组胺的新多铜氧化酶制造技术

本发明专利技术公开了一种高效降解组胺的新多铜氧化酶，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供的多铜氧化酶序列如SEQ ID NO.1所示。该酶具有较强的降解生物胺的性能，降解谱广，能够降解色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺，尤其针对组胺的降解效果好，24h内组胺降解率达到82％，具有重要的工业应用潜力。

A New Polycopper Oxidase with High Degradation Efficiency for Histamine

The invention discloses a novel polycopper oxidase with high efficiency for degrading histamine, which belongs to the technical field of molecular biology. The polycopper oxidase sequence provided by the invention is shown as SEQ ID NO.1. The enzyme has a strong ability to degrade biogenic amines, and has a broad degradation spectrum. It can degrade tryptamine, phenylethylamine, putrescine, cadaveric amine, histamine, tyramine and spermidine, especially for histamine. The degradation rate of histamine reaches 82% within 24 hours, which has important industrial application potential.

【技术实现步骤摘要】
一种高效降解组胺的新多铜氧化酶
本专利技术涉及一种高效降解组胺的新多铜氧化酶，属于分子生物学

技术介绍
生物胺是一类具有生物活性的小分子碱性化合物，广泛存在于发酵食品以及含酒精的发酵饮料中，主要由相应的氨基酸通过微生物的脱羧作用形成，或由醛、酮类物质在氨基酸转氨酶作用下产生。人体摄入过量的外源生物胺后，会产生头痛、恶心、心悸、呼吸紊乱等过敏反应，严重时甚至危及生命，而且多种生物胺共同存在会加强生物胺的毒性作用。食品中常见的生物胺主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺和组胺，其中酪胺和组胺的含量最高，对人体的潜在危害最大。控制和减少发酵产品中的生物胺，目前主要有三种方法：1、控制原料；2、控制发酵体系中产生物胺的微生物；3、酶法降解。前两种方法有一定的局限性，比如会影响某些高蛋白食品的风味，提高设备和能耗费用。而第三种方法通过向发酵食品中添加生物胺降解酶，不造成食品营养物质损失，不产生新的毒性物质。现有的生物胺降解酶包括胺氧化酶和胺脱氢酶，这两种酶存在三个问题：1、降解的生物胺类型少，降解组胺的效率较低；2、最适pH偏中性，不适合应用于酸性发酵食品中；3、活性容易收到某些药物或者化合物的抑制。多铜氧化酶(Multicopperoxidase，MCO)是一类含铜氧化酶家族，其中部分多铜氧化酶能将生物胺催化生成对应的醛、氨和水，达到降解生物胺的目的。目前还没有报道过在酸性含盐的环境中能够高效降解生物胺，尤其是组胺的多铜氧化酶。因此，找到一种高效降解组胺的新型多铜氧化酶，对于降低酸性发酵食品中的生物胺尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的提供了一种来源于发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)的新型多铜氧化酶，可用于降解生物胺，尤其是组胺。本专利技术的第一个目的是提供一种多铜氧化酶，其含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供编码所述多铜氧化酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码多铜氧化酶的基因含有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供一种基因工程菌，表达所述多铜氧化酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以细菌或真菌细胞为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-28a为表达载体。本专利技术的第四个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将编码所述多铜氧化酶的基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将SEQIDNO.2所示的序列与pET-28a连接，转化至大肠杆菌BL21中。本专利技术的第五个目的是提供一种多铜氧化酶的生产方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至培养基中，于16～20℃培养16～24h，收集菌体细胞，破碎细胞获得酶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法将所述基因工程菌接种至TB培养基中，培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG以及铜离子诱导。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法将所述基因工程菌接种至TB培养基中，培养至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5～1mM的IPTG以及0.5～1mM的铜离子诱导。本专利技术的第六个目的是提供所述多铜氧化酶在降解生物胺方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括降低发酵食品中的生物胺含量。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用具体是在食品领域降低酱油中生物胺方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是将所述多铜氧化酶添加至酱油中，降解酱油中的生物胺。在本专利技术的一种实施方式中，所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺中的至少一种。本专利技术还要求保护含有所述多铜氧化酶的制剂。有益效果：本专利技术提供了一种新的多铜氧化酶，该酶的最适pH为3.5，最适温度为50℃，铜离子能够促进酶活提高，使酶活提高3倍。本专利技术将发酵乳杆菌来源的多铜氧化酶在大肠杆菌中异源表达，获得的多铜氧化酶重组酶具有较强的降解生物胺的性能，能够在24h内降解色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺，在总胺约720mg/L的体系中生物胺降解率达42％，其中降解组胺效果最好，24h内组胺降解率达到82％，具有重要的工业应用潜力。附图说明图1为L.fermentum中多铜氧化酶基因的验证图；其中，MMarker；1阴性对照；2L.fermentum中多铜氧化酶基因；图2为温度对多铜氧化酶(简写为MCOF酶)活性的影响；图3为温度对MCOF稳定性的影响；图4为pH对MCOF酶活性的影响；图5为pH对MCOF稳定性的影响；图6为不同金属离子对MCOF酶活的影响；图7为不同浓度铜离子对MCOF酶活的影响；图8为MCOF对不同浓度(w/v，g/100mL)NaCl的耐受性；图9为MCOF对不同浓度(v/v，mL/100mL)乙醇的耐受性；图10为MCOF的Lineweaver-Burk双倒数图。实施例1根据NCBI中Lactobacillusfermentumstrain47-7genome(GenBank登录号为:NZ_CP017712.1)中的多铜氧化酶的基因序列，设计引物，以本研究室保藏的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)基因组为模板，扩增多铜氧化酶基因。扩增所需的引物如下：上游：ATGAATGAACCAGTTTTCGATTC下游：CTACATGTGCATCCCCATCTTPCR反应程序：95℃预变性3min；95℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min30s，34个循环；72℃下延伸10min，4℃下保温。扩增结束后由1％进行琼脂糖凝胶电泳验证，如图1所示，扩增获得大小为1500bp左右的基因片段，与目的基因大小一致，表明L.fermentum中含有多铜氧化酶基因，将PCR产物纯化测序，测序结果如SEQIDNO.2所示。实施例2(1)载体构建：将实施例1获得的基因和pET-28a采用限制性内切酶EcoRI、HindIII双酶切，在37℃金属浴中反应45min。酶切后的基因片段和质粒经过回收纯化后，按摩尔比4～10：1的比例混合，通过SolutionI连接酶进行连接反应，于16℃金属浴中连接过夜。(2)重组菌的构建：向大肠杆菌JM109感受态细胞中加入5μL步骤(1)制备的连接产物，均匀混合后于冰中静置30min。42℃水浴90s后立即取出于冰中放置2-5min。加入700μLLB培养基于37℃，200r·min-1振荡培养1h。4000r·min-1离心2min，弃去大部分上清液，留100μL左右上清液重悬菌体。菌液均匀涂布于含有卡那霉素的平板，置于37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单菌落，通过菌落PCR筛选阳性转化子。酶切并测序验证。挑选测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得重组菌，命名为pET-28a-MCOF/BL21。(3)粗酶液的制备：将重组菌pET-28a-MCOF/BL21接种到LB培养基中，于37℃、220r/min条件下过夜培养。将种子液按1％的接种量转接到TB培养基中，于37℃、220r/min条件下培养至OD600为0.6～0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多铜氧化酶，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种多铜氧化酶，其特征在于，含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述多铜氧化酶的基因。3.表达权利要求1所述多铜氧化酶的细胞。4.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，表达权利要求1所述的多铜氧化酶。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以pET系列质粒为表达载体。6.一种构建权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：方芳，周朝晖，李铁桥，徐洁，卢丽玲，陈坚，
申请(专利权)人：广东珠江桥生物科技股份有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44