猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQ ID NO.8。本发明专利技术的效果在于：利用噬菌体展示技术构建PEDV M蛋白双峰驼源免疫文库，筛选获得8株来自双峰驼IgG重链抗体高变区抗M蛋白VHH抗体基因编码序列，对其进行可溶性表达和ELISA实验证明其均可以同M蛋白相结合，吸光度OD405值的不同表明其同M蛋白结合能力各有差异。8株VHH抗体可通过E.coli的表达，而制备体外重组的基因工程抗体。

Porcine epidemic diarrhea virus M protein specific heavy chain antibody

The invention discloses a specific heavy chain antibody against porcine epidemic diarrhea virus M protein, and the nucleotide sequence of the antibody is SEQ*ID NO.8. The effect of the present invention is to construct a Bactrian camel-derived immune Library of PEDV M protein by using phage display technology, screen and obtain eight anti-M protein VHH antibody gene coding sequences from the highly variable region of Bactrian camel IgG heavy chain antibody, carry out soluble expression and ELISA experiments to prove that they can bind to M protein, and the difference of absorbance OD405 value indicates that their binding ability to M protein is different. Eight strains of VHH antibodies can be expressed by E. coli to prepare recombinant genetic engineering antibodies in vitro.

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体
本专利技术属于生物
，具体涉及以一种猪流行性腹泻病毒M蛋白单域抗体。
技术介绍
猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。感染PEDV的病猪主要通过粪便传播病毒，发病猪主要表现腹泻、呕吐和脱水等临床特征，是导致哺乳仔猪死亡的主要传染病之一。1971年，PED首次在英国发生，随后扩散到世界各地。我国于1980年首次分离到PEDV，2010年国内大部分养猪地区发生PED疫情，从哺乳仔猪到繁殖母猪均有发病，给养猪户造成了严重地经济损失。PEDV属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，基因组是单股正链具有感染性的RNA,与其他冠状病毒相似,基因组5′端有一个帽子结构(cap),3′端有1个Poly(A)尾,基因组全长为2,8033nt，分别编码S、E、M和N等4个病毒结构蛋白。S担保存在的中和表位能够诱导机体产生中和抗体，对仔猪具有良好的保护效果。PEDV感染早期，机体能够产生抗N和N蛋白的高水平抗体，是研发病毒血清抗体诊断方法的候选抗原。E蛋白在抗病毒研究方面具有应用前景。骆驼属外周血中存在的天然缺失轻链的重链抗体（variabledomainoftheheavychainofHCAbs，VHH）具有其他陆生生物所不具备的生物学特征，它的抗原结合位点仅由重链可变区单一结构域组成，却同普通IgG抗体一样保持着良好和特异的抗原结合能力。VHH是目前可以得到的、具有完整功能的、最小IgG抗体分子片段，分子量为15kDa，是常规IgG的1/10，单克隆抗体的1/3，分子高度4.8nm，直径2.2纳米，也称为纳米抗体（nanobody）。VHH抗体抗原结合位点具有伸展的抗原互补结合区和组织穿透性，可结合普通IgG抗体无法接触的抗原表位。另外，体外重组VHH具有易表达和水溶性好等独特性质，在作为小型化基因工程抗体、小分子抗体药物和高灵敏度诊断试剂研发领域具有广阔应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体；本专利技术的另一个目的是提供一种编码所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的核苷酸序列；本专利技术的再一个目的是提供所述的猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体或其编码序列在E.coli中的表达。本专利技术采用以下技术方案，一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2,SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7或SEQIDNO.8。一种重组表达载体，含有上述的核苷酸序列。一种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有上述的核苷酸序列的原核细胞。优选的，所述宿主细胞为含有上述表达载体的原核细胞。所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体或其编码序列在E.coli中的表达。本专利技术的效果在于：利用噬菌体展示技术构建PEDVM蛋白双峰驼源免疫文库，筛选获得8株来自双峰驼IgG重链抗体高变区抗M蛋白VHH抗体基因编码序列，对其进行可溶性表达和ELISA实验证明其均可以同M蛋白相结合，吸光度OD405值的不同表明其同M蛋白结合能力各有差异。8株VHH抗体可通过E.coli的表达，而制备体外重组的基因工程抗体。附图说明图1是是抗PEDVM蛋白VHH克隆氨基酸序列比对结果图；图2是E.coli中抗PEDVM蛋白VHH抗体SDS-PAGE分析图。具体实施方式下面的实施例可以进一步说明本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1、猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的制备1.材料和方法1.1实验动物和试剂2峰10月龄雌性双峰驼作为实验动物，牛淋巴细胞分离液，96孔酶标板；限制性内切酶，DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒为OMEGA产品，镍亲和层析树脂(Qiagen)；E.coli重组表达PEDVM抗原（His标签和GST标签）；菌株、辅助噬菌体和试剂大肠杆菌TG1和BL21Star(DE3)、辅助噬菌体M13K07、载体pHEN2购于NEB公司，其它试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1骆驼免疫和抗体监测首次免疫，用206佐剂（购于法国seepic公司），乳化500μg重组M蛋白皮下多点（背部，后腿和颈部两侧肌肉）接种骆驼。首免21天后加强免疫，剂量为206乳化1000μgM蛋白，与首免间隔35天、42天和63天加强免疫，抗原接种剂量均为1000μgM蛋白。在首次免疫前和每次加强免疫前均采集静脉血并分离到血清，用M蛋白（GST标签）作为抗原的间接ELISA检测PEDV抗体。本次免疫实验过程中，骆驼饲养管理，免疫，血液样品的采集均在专业兽医工作人员监督指导下完成。1.2.2外周血的分离最后一次免疫后7天（即第63天）颈静脉采抗凝血10mL（抗凝剂为肝素钠，10IU/mL），加入等量的Han`s液做1倍稀释，而后加入等体积淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心分离外周血总淋巴细胞。分离的淋巴细胞用MEM重悬中加入到六孔板中（37℃，5%CO2）静止30min，吸附除去细胞碎片和巨噬细胞，离心收集淋巴细胞加入MEM，保存在液氮中用于细胞RNA提取。1.2.3VHH抗体免疫文库构建设计3对引物（参见表1-VHH基因扩增用引物）通过三轮扩增得到编码VHH蛋白目的基因。通过Trizol试剂抽提淋巴细胞总RNA，用G1作为反转录引物，合成第一链cDNA，以cDNA为模板，H1、G1为引物扩增得到600bp和900bp大小2条DNA带，回收600bp条带作为模板，进行第2轮PCR扩增。以第2轮PCR产物为模板，H2、H3为引物得到450bpDNA带。以2轮PCR产物为模板，P1，TN为上下游引物进行第3轮扩增得到450bp带。将第3轮PCR产物经过SfiI/NotI双酶切克隆到pHEN2载体，电转化方法将连接产物转化到TG1中，37℃，180r/min培养1h，离心浓缩后涂在氨苄抗性的2×YTG平板（2%葡萄糖，100μg/mLAmpr）。同时取10μL稀释至1×104倍涂板，37℃过夜培养，计算库容。转化后平板37℃温箱中培养16小时，用10mL的2×YT培养基将培养板上长出的菌苔刮洗干净，加入终浓度25%的甘油，分装保存在-70℃备用，此为获得的抗PEDVM蛋白VHH免疫抗体库。随机挑选电转化后的克隆进行测序，根据多样性和克隆数目来计算库容量。1.2.4通过二次筛选过程获得特异的抗PEDVM蛋白VHH抗体筛选抗体操作步骤如下：（1）抗原包被：将M抗原（GST标签）稀释至20ug/ml，50ul/孔，4℃过夜。PBS洗3次；（2）封闭：加入300ul/孔的2%M-PBS，与37℃封闭1h，PBS洗3次；（3）结合：取20ulphage+180ul0.1MPBS，混匀，50ul/孔，37℃静置1h；甩出多余的噬菌体溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液，0.1%PBST洗3次；（4）一抗：用0.1MPBS按1：1000稀释兔抗M1350ul/孔37℃静置1h；甩出多余的液体，倒置平板在纸巾上拍甩除去残液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，其特征在于，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQ ID NO.8。

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，其特征在于，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQIDNO.8。2.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列。3.一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求1所述的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹双辉，杨顺利，尚佑军，蔡建平，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62