鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法及其产品技术

本发明专利技术公开了鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法及其产品。所述制备方法包括：(1)将鹅星状病毒液与佐剂配制后作为免疫原免疫健康产蛋鹅制备得到高免蛋，收集高免蛋；(2)将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；采用酸水‑卡拉胶法从卵黄中提取卵黄抗体。本发明专利技术制备方法所提取的鹅星状病毒卵黄抗体的回收率大于93％，纯度大于95％，在回收率、提取量、纯度等指标上均显著优于采用现有方法制备得到的鹅星状病毒卵黄抗体。采用本发明专利技术制备的鹅星状病毒卵黄抗体，只需要0.5ml的预防剂量能起到较好的保护效果，对强毒的攻毒保护率达到100％。本发明专利技术可针对性的防治鹅星状病毒的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。

【技术实现步骤摘要】
鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法及其产品
本专利技术涉及鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，本专利技术进一步涉及由该制备方法得到的鹅星状病毒卵黄抗体及其应用，属于鹅星状病毒卵黄抗体的制备和应用领域。
技术介绍
小鹅瘟(Goslingplague)，又称鹅细小病毒感染，是雏鹅的一种急性败血性传染病，以精神萎顿、食欲废绝、严重下痢，有时出现神经症状，死亡率高为临诊特点，可经消化道和呼吸道感染，并可经卵垂直传播。本病主要侵害4～20日龄的易感雏鹅，具有传播快、发病率高和致死率高的特点。目前本病呈世界性分布，常引起雏鹅大批死亡，对养鹅业的发展影响极大。卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，因此称其为卵黄免疫球蛋白IgG(yolkantibody)，简称为IgY。当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG，单个卵黄(约15ml)中卵黄抗体含量可达200mg左右。再加之从卵黄中提取抗体较从动物血清中提取抗体简便，因此卵黄抗体具有明显的技术优势。现有的鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法存在回收率低、纯度不高以及免疫保护效果不够理想等缺陷，有待改进。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，该制备方法具有回收率高、纯度高，所获得的鹅星状病毒卵黄抗体免疫保护效力高等优点；本专利技术的目的之二是将所制备的鹅星状病毒卵黄抗体应用于防治鹅星状病毒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术提供了一种鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，包括：(1)将鹅星状病毒液与佐剂配制后作为免疫原免疫健康产蛋鹅制备得到高免蛋，收集高免蛋；(2)将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；采用酸水-卡拉胶法从卵黄中提取卵黄抗体；其中，步骤(1)中将鹅星状病毒液与油乳佐剂混合配制得到油乳佐剂免疫原；为了实现更好的免疫效果，优选的，将鹅星状病毒液与油乳佐剂按照1:1.5(V/V)的体积比例混合配制得到油乳佐剂免疫原。本专利技术通过优化实验发现，采用下述的免疫程序能够有效的提高免疫效果：(1)基础免疫：将鹅星状病毒油乳佐剂免疫原皮下注射健康产蛋鹅星状病毒，每只1.0ml；(2)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只1.5ml；(3)强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(4)维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。步骤(1)中所述高免蛋的收集方法包括：产蛋鹅星状病毒强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鹅星状病毒蛋黄中抗体效价，当中和指数≥500时，收集高免蛋。步骤(2)中所述的酸水-卡拉胶法包括：(a)去除卵黄中的脂肪；优选的，所述的去除卵黄中的脂肪的方法包括：将卵黄与0.12mol/L，pH5.0的醋酸盐缓冲液混合均匀后调至pH5.2，置2～8℃静置，取上清液；其中，卵黄与0.12mol/L，pH5.0的醋酸盐缓冲液按照5:1的体积比进行配制；所述的静置时间优选为4小时；(b)萃取：将上清液与λ-卡拉胶按照1mL上清液:6mgλ-卡拉胶的配比进行混合搅拌后静置；取上清液过滤后，滤液调至pH7.2；(c)过滤及浓缩：滤液加入辛酸后再进行过滤，将滤液浓缩；其中，所述的过滤优选采用孔径为1.0μm和0.45μm的筒式滤芯过滤；所述的浓缩是采用截留分子量为100kD的中空纤维超滤柱进行浓缩10倍；(d)将浓缩液进行灭活、稀释、除菌，即得；其中，所述的灭活是按终浓度为0.05％加入甲醛溶液，搅拌混匀，室温灭活24小时；所述的稀释是将浓缩灭活卵黄抗体用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释为琼扩抗体效价不低于1:4；所述的除菌是用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌。本专利技术制备方法所提取的鹅星状病毒卵黄抗体的回收率大于93％，纯度大于95％，在回收率、提取量、纯度等指标上显著优于采用现有制备方法得到的鹅星状病毒卵黄抗体。抗体最小预防剂量试验表明，采用本专利技术制备的鹅星状病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鹅，0.5ml的预防剂量能起到较好的保护效果。根据抗体预防试验结果可见，采用本专利技术制备的鹅星状病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鹅对强毒的攻毒保护率均为100％。本专利技术制备的鹅星状病毒卵黄抗体可安全、有效的预防鹅星状病毒引起的以拉石灰样稀便、脱水、消瘦、瘫痪和死亡鹅剖检病理变化为肾肿大、斑驳、输尿管有白色尿酸盐沉积物，内脏、关节、皮下等有白色尿酸盐附着、结晶为临床症状的痛风病。根据抗体被动免疫期试验结果可见，将本专利技术制备的鹅星状病毒卵黄抗体注射1日龄健康易感鹅，注射抗体后1～5日攻毒保护率为80～100％，7日攻毒保护率为80％以下，说明注射抗体后5日抗体仍能产生良好地保护作用，因此，本专利技术制备的卵黄抗体的被动保护期为5日。本专利技术可以有针对性的防治鹅星状病毒的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1鹅星状病毒卵黄抗体的制备一、试验材料及制备方法生产用毒株：制苗免疫原用鹅星状病毒HLJ株，由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管并对外出售。1病毒原液的制备用灭菌生理盐水将生产用毒种作10000倍稀释，经卵黄囊接种11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育。弃去48小时前死亡的鸭胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集48～120小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时。鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存，并取样进行病毒含量(ELD50)测定。HLJ株病毒含量应不低于106.0ELD50/0.1ml。2抗原浓缩与灭活将检验合格的抗原于2～8℃条件下解冻、混合，于4℃条件下4000rpm离心30min，取上清液用4层灭菌纱布过滤，收集滤液用截留分子量为6KD的中空纤维超滤器浓缩10倍，浓缩液加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，密闭后置37℃温箱中灭活24小时(其间4～6小时振摇1次，每次3分钟)，于4℃保存备用，同时取样用于检验。灭活后的病毒液置2～8℃保存，有限期为30日。3油乳佐剂免疫原的配制按灭活病毒液与油佐剂1:1.5(V/V)的比例进行配制。将1.5份油相注入预混罐中，低温搅拌的同时，缓慢加入1份水相，再注入乳化罐乳化5分钟。乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15min，如不分层，终止搅拌，无菌操作分装至250ml无菌瓶。4免疫原的检验4.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。4.2安全检验用1～3日龄的SPF鹅10只，每只胸部皮下接种2.0ml，观察14日，全部健活。5抗体制造及半成品检验5.1高免蛋鹅星本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：(1)将鹅星状病毒液与佐剂配制后作为免疫原免疫健康产蛋鹅制备得到高免蛋，收集高免蛋；(2)将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；采用酸水‑卡拉胶法从卵黄中提取卵黄抗体。

【技术特征摘要】
1.一种鹅星状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：(1)将鹅星状病毒液与佐剂配制后作为免疫原免疫健康产蛋鹅制备得到高免蛋，收集高免蛋；(2)将高免蛋的蛋壳消毒后，收集卵黄；采用酸水-卡拉胶法从卵黄中提取卵黄抗体。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将鹅星状病毒液与油乳佐剂混合配制得到油乳佐剂免疫原；优选的，将鹅星状病毒液与油乳佐剂按照1:1.5的体积比例混合配制得到油乳佐剂免疫原。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述免疫的程序包括：(1)基础免疫：将鹅星状病毒油乳佐剂免疫原皮下注射健康产蛋鹅星状病毒，每只1.0ml；(2)加强免疫：基础免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只1.5ml；(3)强化免疫：加强免疫21日后，皮下注射相同的油乳佐剂免疫原，每只2.0ml；(4)维持免疫：在强化免疫接种后根据抗体效价，每隔2～3个月再加强接种1次，每只2.0ml。4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述高免蛋的收集方法包括：产蛋鹅星状病毒强化免疫接种结束后10日，每隔5日抽样测定高免鹅星状病毒蛋黄中抗体效价，当中和指数≥500时，收集高免蛋。5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的酸水-卡拉胶法包括：(a)去除卵黄中的脂肪；(b)萃取：将上清液与λ-卡拉胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋扬，赵辉，柴华，卢爱国，李应鹤，李琳，李贽，武啸，刘鑫莹，曲海波，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23