一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法技术

本发明专利技术公开了一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法，具体的实验过程如下：（1）实验材料准备；（2）细胞培养与处理；（3）RT‑PCR测定；（4）Western Blot测定；（5）Annexin V‑FITC染色；（6）生物信息数据库筛选与分析；（7）转录因子筛选测定；（8）Hoechst 33324染色；（9）体外动力学结合分析；（10）统计分析。本发明专利技术的有益条件在于：通过miR30b‑p53‑PTPN11/SHP2信号通路诱导来实现人肝癌细胞HepG2凋亡。

An experimental method of tanshinone IIA inducing apoptosis of cancer cell HepG2

The present invention discloses an experimental method of tanshinone IIA inducing apoptosis of cancer cell HepG2. The specific experimental process is as follows: (1) preparation of experimental materials; (2) cell culture and treatment; (3) RT PCR assay; (4) Western Blot assay; (5) Annexin V FITC staining; (6) screening and analysis of biological information database; (7) screening and determination of transcription factors; (8) Hoechst 33324 staining; (9) in vitro dynamic binding analysis; (10) statistical analysis. The beneficial condition of the invention is that apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell HepG2 can be induced by micro30b_p53_PTPN11/SHP2 signaling pathway.

【技术实现步骤摘要】
一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法
本专利技术涉及治疗肝癌方法的
，特别是一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法。
技术介绍
在过去几十年中，全球肝癌的发病率持续增加。仅2008–2010年间，全球因肝癌而死亡的病例从695900例增加到745500例，其中约一半发生在中国。近年来，研究表明肝癌的发生及发展涉及多个生物学信号传导途径。但由于肝癌发病机制复杂，寻求有效治疗药物一直是备受关注的热点问题。因此，关注多靶点药物的研究是药理学家研究肝癌治疗的关键。中药以其多药理学作用机制，有效干预多种疾病而闻名，这为我们治疗病因复杂的肝癌提供了研究思路。丹参酮IIA是唇形科植物丹参干燥根的提取物，是一种心脏保护剂，肝脏保护剂。目前有文献报道丹参酮IIA主要是通过p53依赖性线粒体凋亡途径诱导肝癌细胞凋亡。然而，丹参酮IIA干预肝癌、诱导肝癌细胞凋亡的其它分子机制仍需进一步研究。MicroRNA是一组通过控制mRNA降解和翻译来调节转录后基因表达的非编码单链RNA小分子。研究表明miRNA在生物学行为中起着关键作用。迄今为止，约一半的miRNA被估计位于癌症相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法，其特征在于，具体的实验过程如下：（1）实验材料准备：丹参酮IIA（> 98.0％）；p53，Bcl2和SHP2抗体；通过primer 5.0设计了Tp53，PTPN11，miR30a，b，c和d，Bax，Bcl2和p21的mRNA序列；Annexin V‑FITC染色试剂盒和3‑（4，5‑二甲基‑2‑噻唑基）‑2，5‑二苯基四唑溴化物（MTT）溶液；细胞培养基DMEM和胎牛血清（FBS）；（2）细胞培养与处理：人肝癌细胞为HepG2和Hep3B，将细胞用含有10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养液于37...

【技术特征摘要】
1.一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法，其特征在于，具体的实验过程如下：（1）实验材料准备：丹参酮IIA（>98.0％）；p53，Bcl2和SHP2抗体；通过primer5.0设计了Tp53，PTPN11，miR30a，b，c和d，Bax，Bcl2和p21的mRNA序列；AnnexinV-FITC染色试剂盒和3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）溶液；细胞培养基DMEM和胎牛血清（FBS）；（2）细胞培养与处理：人肝癌细胞为HepG2和Hep3B，将细胞用含有10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养液于37℃，5％CO2条件下培养，当汇合时，用一系列剂量的丹参酮IIA处理细胞，24小时后，收集培养基和细胞，并制备用于以下生物测定；（3）RT-PCR测定：根据试剂盒说明从细胞中提取总RNA，通过NanoDrop测定RNA的质量，相应基因的扩增通过AppliedBiosystems进行，通过2-△△CT计算数据，并与空白样品相比分析每个基因的诱导倍数；（4）WesternBlot测定：用具有1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解物分离总细胞蛋白，蛋白质浓度按照BCA试剂盒说明书的指导进行测定，在SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶上分离约50μg蛋白质，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在5％脱脂奶粉中封闭后，将膜与抗体在4℃下孵育过夜，第二天，将膜与第二抗体杂交，通过使用化学发光试剂观察蛋白质，并在ChemiScope上观察，并使用软件ChemiAnalysis来计算蛋白质条带的密度；（5）AnnexinV-FITC染色：收集细胞并用5μLAnnexinV-FITC和10μLPI染色，在黑暗中孵育至少5分钟后，通过流式细胞术分析凋亡细胞；（6）生物信息数据库筛选与分析：我们对59篇文献中所涉及到的部分基因进行了一下整理，过滤掉人意外物种的基因，修正基因symbol，过滤重复基因，最终得到61个基因，GeneCodis是一个整合了各种分析工具和数据的生物信息数据库，为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息，在此，我们使用GeneCodis对这61个基因集执行Go富集分析和信号通路功能注释，GeneMania数据库通过嵌入软件cytoscape能对61列表基因进行相关关系网络图谱绘制，61个选择的基因的网络由GeneMania自动产生并通过Cytoscape显现，Gene2Networks整合了十个哺乳动物相互作用网络数据...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘红莲，
申请(专利权)人：潘红莲，
类型：发明
国别省市：浙江,33