使用官能化色谱介质回收病毒产品的方法技术

本发明专利技术提供从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都实质上不含多核苷酸。

Recovery of Virus Products Using Functionalized Chromatographic Medium

The invention provides a method for recovering viral products from compositions comprising the products and product-related impurities. The method includes contacting the compositions with a functionalized chromatographic medium containing one or more polymer nanofibers, in which the viral products contain many viruses, virus particles/virus particles, virus core, virus peeled from membrane, and removing outer membranes. Each of the viral cores or viruses removing the capsid contains one or more polynucleotides, and the product-related impurities include many viruses, viral particles/viral particles, viral-like particles, viral cores, membrane-peeled viruses, virus cores removing outer membranes and/or capsid cores or viruses, each of which essentially contains no polynucleotides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用官能化色谱介质回收病毒产品的方法专利
本专利技术涉及从包含病毒产品(通常是装填的病毒媒介)和产品相关杂质(通常是未装填的病毒)二者的组合物回收病毒产品的方法。所述方法包括使组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触。介绍生物技术市场是全球药物市场内增长最快的行业，占2012年所有市场销售额的20%(1530亿美元)。从2002年10%的市场份额起的这一增长在2012年至2018年间估计增长41%，从1530亿美元到2150亿美元。一个代表未来很大增长潜力的领域是基因治疗。这种治疗方法有可能纠正遗传性基因缺陷，或者离体或体内操纵细胞来处理疾病例如癌症(Davila等人，2014)、血友病(Nathwani等人，2014)和帕金森病(Kaplitt等人)。在基因治疗方法中，将目标基因递送到细胞中需要使用媒介。正为临床应用而开发的许多这种媒介衍生自重组病毒，例如腺病毒(Adv)、腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)。媒介在基因治疗中的目的是将核酸序列(DNA或RNA)递送到细胞，其中它通过细胞的生化机构受到处理以改变细胞的性质，产生期望的治疗效果。媒介材料通常由已被改性以产生媒介的组成部分(例如其包衣或衣壳)的细胞系和打算递送到细胞的核酸材料产生。在媒介产生过程期间，需要将核酸序列掺入媒介中以形成“装填”或“满的”媒介。“活性”或“感染性”媒介是“装填”媒介，其可以成功感染靶细胞，导致核酸序列的表达。在典型的媒介产生过程中也产生本质上不含核酸材料的“空的”或“未装填”媒介。因此，在媒介产生过程期间，产生含有上述变体的混合物的混合群体。将装填的媒介与空的媒介分离通常通过使用密度梯度离心在实验室规模进行，例如利用密度差异进行分离的CsCl梯度(Vellekamp等人，2001)或碘克沙醇梯度(MartinLock等人，2010)。然而，对于用于处理大型患者群体的工业规模纯化，这种方法是不合适的，因为它们在按比例放大时造成实施挑战。因此，已经应用某些色谱分离方法，因为它们固有地更可升级。为了将满的AAV媒介与空的媒介分离，许多市售可得的基于多孔珠的系统已经用于离子交换分离(Urabe等人,2006)(Qu等人,2007)。使用具有阴离子交换功能性的整料也报道类似的分离(M.Lock,Alvira,&Wilson,2012)。此外(Lee,Kim,&Seol,2009)报道使用金属亲和膜可以将感染性AdV材料与有缺陷的AdV颗粒分离。然而，使用这些已知的吸附材料进行色谱分离、包括将装填的病毒媒介与未装填的媒介分离存在缺点。因此，虽然常规的多孔珠具有高容量，但不可能以高流速操作包含这种珠的填充床系统。这是因为在基于多孔珠的系统中，靶分子/杂质和固相之间的结合事件取决于向多孔珠中的扩散，意味着结合容量随着停留时间的减少而下降。高流速也与其中许多升的珠悬浮液被装填到柱中的制造规模下的多孔珠特别不相容。这里，多孔珠的机械不稳定性可导致压缩或坍塌事件，这继而导致不均匀的柱床。多孔珠的典型结合容量在35-120mg/mL附近，取决于固相的功能性和结合的物类。然而，通过这种系统的低典型流速意味着可以实现仅约10-120mg/mL/min的单柱多孔珠系统的总生产率。使用多孔珠的另一个缺点是材料的容量取决于靶进入珠的内表面区域的能力。典型的多孔珠的孔径在15-30nm之间，且因此在媒介纯化中存在局限，其中靶媒介可以比孔径大得多，例如为AAV(~20nm)、AdV(~80nm)和LV(~100nm)。涉及膜和整料的分离可以在比基于多孔珠的系统高得多的流速下进行，典型的停留时间为约0.2-0.5分钟级。然而，在动态流动下，靶的10%穿透的典型结合容量对于整料(10-20mg/mL)和膜(7.5-29mg/mL)低于多孔珠(Gottschalk,U.2008BiotechnolProg,24(3),496-503.doi:10.1021/bp070452g)。整料和膜材料的较差结合容量(与基于多孔珠的材料相比)可以通过利用更高的流速在一定程度上弥补。上面讨论的整料和膜的典型结合容量和停留时间导致整料和膜系统的结合事件的总生产率为约10-145mg/mL/min。另外，虽然膜的孔径远大于多孔珠，在0.2-2μm的范围内，但是膜的结合容量随着吸附物类的尺寸增加而降低(Wickramasinghe,Carlson,Teske,Hubbuch,&Ulbricht,2006)。这强调需要高度多孔吸附剂与高可及表面积二者。对能够将装填的与未装填的媒介分离的色谱材料存在需要，以使得能够以工业规模回收治疗产品。色谱材料还应共享与基于多孔珠的材料相关的高结合容量和用整料/膜材料可实现的较高流速。色谱材料还必须是足够多孔的，因此大媒介可到达结合区域，从而可以获得适当高的流速。这种材料可在高流速下提供高容量，以实现最大生产率(纯化的产品/mL/min)。本专利技术人意料不到地发现，聚合物纤维材料，尤其是聚合物纳米纤维材料，可用于将装填的与未装填的媒介材料分离。因此，他们发现这种材料在非常短的停留时间即高流速下对媒介材料具有高容量。这表示与其他吸附剂例如珠、膜和整料相比，该材料具有有利的高生产率。本专利技术人还优化了聚合物纤维材料的聚合物接枝和随后的官能化的程度，以改善装填和未装填物类的拆分。还意料不到地发现，使用根据本专利技术的材料，装填和未装填的级分二者都可以在非常低的盐浓度下洗脱(洗脱电导率<6mS)。这与文献中的实例形成对比，在文献中级分不被洗脱直到电导率达到~12.5mS(Urabe等人,2006)。专利技术概述因此，本专利技术提供从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都实质上不含多核苷酸。本专利技术还提供：·一种从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与不耐盐的色谱介质接触，其中所述不耐盐的色谱介质能够以小于10mS/cm的电导率洗脱病毒产品。·一种从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与膜或片形式的色谱介质接触且将所述组合物通过包括一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料(frit)或其他隔离材料的保持器，其中将所述组合物通过保持器使得(a)通过所述一个或多个膜或片的路径长度小于2mm或(b)通过膜、片、熔料和其他隔离材料的总路径长度小于50mm。·一种从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与膜或片形式的色谱介质接触且将所述组合物通过包括一个或多个所述膜或片和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都实质上不含多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.14 GB 1612248.31.从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都实质上不含多核苷酸。2.根据权利要求1的方法，其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都能够感染细胞。3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述病毒产品包含许多病毒媒介，每一种都含有一种或多种转基因多核苷酸。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都不能感染细胞。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都缺乏完整病毒基因组。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述病毒选自腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述病毒选自腺相关病毒。8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质由一种或多种非织造聚合物纳米纤维形成。9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一种或多种聚合物纳米纤维用一种或多种配体基团官能化，所述配体基团可以是相同或不同的，且使得包含所述一种或多种配体基团的聚合物纳米纤维适合用作色谱介质。10.根据权利要求9的方法，其中可以是相同或不同的所述一种或多种配体基团结合到所述一种或多种聚合物纳米纤维。11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一种或多种聚合物纳米纤维具有与其共价结合的一个或多个聚合物链，所述聚合物链可以是相同或不同的。12.根据权利要求11的方法，其中可以是相同或不同的所述一个或多个聚合物链具有与其结合的一种或多种配体基团，所述配体基团可以是相同或不同，且使得包含所述一个或多个聚合物链和所述一种或多种配体基团的所述聚合物纳米纤维适合用作色谱介质。13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质适合用于选自离子交换、疏水相互作用和混合模式方法的色谱方法。14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质具有50μmol/g至1,500μmol/g官能化色谱介质的配体基团密度。15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质具有至多50mg/mL(10%穿透)的动态结合容量。16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述组合物具有溶解盐浓度，使得电导率低于30mS/cm。17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质是膜或片的形式。18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质为膜或片的形式，且将所述组合物通过包含一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料或其他隔离材料的保持器。19.根据权利要求18的方法，其中将所述组合物通过所述保持器，使得(a)通过所述一个或多个膜或片的路径长度小于2mm或(b)通过膜、片、熔料和其他隔离材料的总路径长度小于50mm。20.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使所述组合物与所述官能化色谱介质接触一分钟或更少的时间段。21.根据前述权利要求中任一项的方法，包括以下步骤：(i)使所述组合物与所述官能化...

【专利技术属性】
技术研发人员：I斯坎伦，
申请(专利权)人：纯化迪发有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB