基因治疗载体的表征制造技术

本发明专利技术公开了区分病毒制剂中的空衣壳和完整衣壳或装载和未装载的非病毒基因治疗载体的方法。该方法包括以下步骤：a)提供病毒颗粒或基因治疗载体的制剂；b)在干涉散射显微镜中，使制剂经受干涉散射质谱法(ISCAMS)，以生成病毒颗粒的质量分布数据；c)由质量分布数据来确定病毒颗粒中空衣壳和包含基因组的衣壳的水平或装载和未装载的载体的水平。的水平或装载和未装载的载体的水平。的水平或装载和未装载的载体的水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因治疗载体的表征


[0001]本专利技术涉及基因治疗载体和病毒颗粒的表征，且更具体地涉及确定病毒颗粒的制剂中的空衣壳和完整衣壳水平的方法。

技术介绍

[0002]重组病毒显示了作为递送用于基因治疗应用的治疗性核酸的媒介物的巨大前景和实用性。基于许多因素，包括待递送核酸的大小、递送核酸的靶细胞或组织、对于治疗性核酸的短期或长期表达的需要以及治疗性核酸进入受体基因组内的整合，在这些基因治疗应用中使用许多不同的重组病毒。基因治疗应用中使用的病毒的实例包括腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒(HSV)。另外，也可使用非病毒载体用于基因治疗中的核酸递送。此类载体的实例包括脂质体和其它脂质复合物(lipoplex) (参见例如US2009305409、US6749863、US6071533和US6303378，在此通过引用以其整体并入)、聚合物囊泡(polymersome)和聚合复合物(polyplex) (参见例如US20110206751、US2017000743和US2011151013，在此通过引用以其整体并入)，以及无机纳米颗粒和有机纳米颗粒。
[0003]聚合酶链反应(PCR)是用于确定腺相关病毒(AAV)的基因组含量的常用技术，并且分析型超速离心(AUC) (参见例如US2018180525，在此通过引用以其整体并入)通常用于估计空衣壳(仅含有蛋白质衣壳而不含DNA)和完整衣壳(含有蛋白质和DNA两者)的水平。另外，分光光度法(例如WO2019212922，在此通过引用以其整体并入)已被用于确定空衣壳和完整衣壳的水平。然而，这些技术需要多重步骤，伴随耗时且相对低流通量的复杂程序。因此，更有效和更好的定量技术对于样品筛选、用于工艺控制和监测的工艺中样品分析以及最终产物浓度确定和稳定性监测是期望的。
[0004]相应地，需要简单且快速的方法，以关于空衣壳和完整衣壳来表征病毒制剂。同样地，需要简单且快速的方法，以关于其是否装载预期核酸来表征非病毒载体。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个方面是提供区分病毒制剂中的空衣壳和完整衣壳的方法。这用包括以下步骤的方法来实现：a) 提供病毒颗粒的制剂；b) 在干涉散射显微镜中，使制剂经受干涉散射质谱法(ISCAMS)，以生成病毒颗粒的质量分布数据；c) 由质量分布数据来确定病毒颗粒中的空衣壳和包含基因组的衣壳的水平。
[0006]一个优点是该方法是快速(几分钟)且简单的并且具有高准确度。进一步的优点是该方法能够测量来自其中存在不同大小颗粒的复杂混合物的样品的颗粒；较小的颗粒不因较大颗粒的存在而“隐藏”。再进一步的优点是需要最少量的样品(<~20
ꢀµ
l)。这些优点使得该方法成为用于在线工艺分析测试(PAT)的特别有用的技术。
[0007]本专利技术的第二个方面是提供区分装载有核酸的非病毒基因治疗载体与未装载核
酸的载体的方法。这用包括以下步骤的方法来实现：a) 提供非病毒基因治疗载体的制剂；b) 在干涉散射显微镜中，使制剂经受干涉散射质谱法(ISCAMS)，以生成载体的质量分布数据；c) 由质量分布数据来确定装载有核酸的载体和未装载核酸的载体的水平。
[0008]在从属权利要求中描述了本专利技术的进一步合适的实施方案。
附图说明
[0009]图1显示了AAV血清型5的空衣壳样品的质量分布。
[0010]图2显示了AAV血清型5的完整衣壳样品的质量分布。
[0011]图3显示了AAV血清型5的空衣壳和完整衣壳的1:1混合物的质量分布。
[0012]图4显示了AAV血清型5的空衣壳和完整衣壳的2:1混合物的质量分布。
[0013]图5显示了完整AAV血清型5衣壳在以下中的质量分布：a) PBS缓冲液+ 130 mM NaCl，0.001% (v/v) Pluronic F
‑
188b) PBS缓冲液+ 130 mM NaCl，0.001% (v/v) Pluronic F
‑
188 (重复)c) 无盐的20 mM TRIS缓冲液pH 8.5d) 无盐的20 mM TRIS缓冲液pH 8.5 (重复)。
[0014]图6显示了在稀释1000x的制剂中的完整AAV血清型5衣壳的质量分布。
[0015]定义如本文所使用的，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”、“具有”等等可以具有美国专利法中赋予其的含义，并且可以意指“包括(includes)”、“包括(including)”等等；“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”或“基本上由
……
组成(consists essentially)”同样具有美国专利法中赋予的含义，并且该术语是开放式的，允许存在比所叙述的内容更多的内容，只要所叙述内容的基本或新型特性不因存在比所叙述的内容更多的内容而改变，但排除现有技术实施方案。
具体实施方式
[0016]在一个方面，本专利技术公开了表征病毒颗粒的制剂的方法，其包括以下步骤：a) 提供病毒颗粒的制剂。制剂可以例如是预期用作细胞/基因治疗的病毒载体的病毒颗粒的制剂，但它们也可以预期用作例如疫苗抗原。特别地，它们可以选自腺相关病毒(AAV)、腺病毒(AV)、单纯疱疹病毒(HSV)、逆转录病毒、慢病毒和甲病毒，其中AAV是优选的。病毒颗粒可以适当地是重组的，在衣壳中具有改造的基因组，并且制剂还可以包括空衣壳。制剂可以包含至少5x108个病毒颗粒/ml制剂，例如至少1x109个病毒颗粒/ml制剂、5x108ꢀ‑ꢀ
1x10
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或1x109ꢀ‑ꢀ
1x10
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个病毒颗粒/ml制剂。制剂可以适当地包含缓冲液，例如PBS或Tris缓冲液，其可以具有3
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9 (例如6
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8.5或7
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8.5)的pH，并且可以进一步包含盐，例如NaCl。进一步地，制剂可以包含分散剂，例如泊洛沙姆(环氧乙烷
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环氧丙烷嵌段共聚物)。泊洛沙姆分散剂的实例可以是泊洛沙姆188 (目录号9003
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6)，例如Pluronic F
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188 (BASF)或Pluronic F
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68。制剂通常可以是细胞培养流体(例如细胞裂解物)、部分纯化的细胞培养流体/细胞裂解物或源自细胞培养流体/细胞裂解物的病毒颗粒的纯化悬浮液。
[0017]b) 在干涉散射显微镜中，使制剂经受干涉散射质谱法(ISCAMS)，以生成病毒颗粒的质量分布数据。在此步骤中，可以测量来自表面上的各个病毒颗粒的散射光强度，并且由散射光强度分布来计算质量分布数据。干涉散射显微镜可以如US20190004299 (在此通过引用以其整体并入)中公开的进行构造，并且它可以特别是从Refeyn本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.表征病毒颗粒的制剂的方法，其包括以下步骤：a) 提供病毒颗粒的制剂；b) 在干涉散射显微镜中，使所述制剂经受干涉散射质谱法(ISCAMS)，以生成所述病毒颗粒的质量分布数据；c) 由所述质量分布数据来确定所述病毒颗粒中的空衣壳和包含基因组的衣壳的水平。2.权利要求1的方法，其中在步骤b) 中，测量来自存在于表面上的各个病毒颗粒的散射光强度，并且由散射光强度分布来计算所述质量分布数据。3.权利要求1或2的方法，其中在步骤b) 中，病毒颗粒存在于玻璃表面上，例如载玻片或盖玻片表面上。4.权利要求3的方法，其中所述玻璃表面是化学修饰的。5.权利要求3或4的方法，其中所述玻璃表面用能够结合所述病毒颗粒的配体进行衍生化。6.任一前述权利要求的方法，其中所述制剂包含至少5x108个病毒颗粒/ml制剂。7.任一前述权利要求的方法，其中所述制剂包含缓冲液。8.权利要求7的方法，其中所述缓冲液是PBS或Tris缓冲液。9.任一前述权利要求的方法，其中所述制剂包含盐，例如NaCl。10.任一前述权利要求的方法，其中所述制剂包含分散剂。11.任一前述权利要求的方法，其中所述分散剂是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188。12.任一前述权利要求的方法，其中所述病毒颗粒是腺相关病毒(AAV)颗粒。13.任一前述权利要求的方法，其中所述病毒颗粒是病毒载体颗粒。14.任一前述权利要求的方法，其中所述干涉散射显微镜包括：用于将样品保持在样品位置的样品架；布置为提供照明光的照明源；检测器；光学系统，其布置为将照明光引导到所述样品位置上，并且进一步布置为收集反射中的输出光，所述输出光包括从所述样品位置散射的光以及从所述样品位置反射的照明光两者，并且再进一步布置为将所述输出光引导到所述检测器；和放置为过滤所述输出光的空间滤光器，所述空间滤光器布置为使输出光通过，但具有在预定数值孔径内比在较大数值孔径处更大的强度减少。15.权利要求14的方法，其中所述样品架包括表面并且病毒颗粒存在于所述表面上。16.权利要求15的方法，其中所述表面是玻璃表面，例如载玻片或盖玻片表面。17.权利要求15或16的方法，其中所述表面是微流体通道或多孔板的表面。18.任一前述权利要求的方法，其中所述干涉散射显微镜是Refeyn OneMP显微...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：纯化迪发有限公司，
类型：发明
国别省市：