一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法及试剂技术方案

快速、准确的一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，包括步骤：(1)制备基因分型样本的人基因组DNA；(2)提供扩增引物，用聚合酶链反应同步扩增所述基因组DNA中5个血型系统12个抗原对应的基因序列；(3)将步骤(2)得到的扩增产物作双酶切纯化；(4)提供测序引物，将步骤(3)所得纯化产物分别作测序PCR反应；(5)将步骤(4)所得测序反应产物作醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)所得序列经软件分析，确定其血型抗原基因型；所述扩增引物和测序引物为序列号1‑14的，所述方法所用试剂具有所述扩增引物和测序引物。本发明专利技术用于种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型。

【技术实现步骤摘要】
一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法及试剂
本专利技术涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种同步检测5个红细胞血型系统12个主要抗原基因分型的分子生物学检测方法及该方法所用的试剂。
技术介绍
个体红细胞血型抗原具有遗传多态性，到2018年11月已发现的人红细胞血型系统有36个，超过350多种抗原。准确的识别个体红细胞血型有助于精准血型的配合。传统的鉴定红细胞血型的方法是基于抗原抗体凝集的血型血清学技术，该技术在ABO、RhD血型鉴定中得到广泛应用，优点是操作简单易行、试剂成本低廉。但血型血清学技术有其局限性，主要表现为：1)检测需要新鲜的红细胞，不利于标本的长期保存；2)有近期输血史的待检者样本，往往混入ABO/RhD同型但其他血型不相同的输入性红细胞，影响ABO/RhD血型以外的其他血型抗原的准确鉴定；3)多种血型变异体样本，应用单纯的血型血清学技术，往往存在分型错误的风险；4)ABO、RhD以外的血型抗体试剂，普遍产量低、价格昂贵，不利于大样本的检测；5)某些血型抗原缺乏相应的商品化抗体试剂，如Dombrock、Colton、Diego等血型系统的大部分抗原，都没有商品化抗体试剂可售。血型基因分型技术是弥补血型血清学技术缺陷的有效方法，早期的血型基因分型多采用等位基因特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)，但这个方法准确性较低，后来又发展了荧光定量溶解曲线、固相芯片杂交、液相Luminex、测序分型(PCR-SBT)等技术。其中以PCR-SBT技术的准确性最高，但除了ABO、RhD等血型建立了PCR-SBT方法，大部分的血型系统尚未有PCR-SBT方法进行基因分型，而且现有的PCR-SBT血型基因分型方法，往往一次只能对一种血型进行鉴定，检测通量较低。因此，建立一种同步检测多个血型系统多个抗原的PCR-SBT分型方法具有重要价值。
技术实现思路
本专利技术要解决现有技术中人类红细胞血型抗原基因分型检测通量低，耗时大，准确率不高等问题，为此提供本专利技术的一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法及试剂，由此解决了5个红细胞血型系统中12个抗原准确定型的问题，发挥PCR-SBT技术对多个血型基因分型的高通量、高准确性的特点，可准确鉴定个体红细胞血型。为解决上述问题，本专利技术采用的技术方案其主题一是一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，二是所述分型方法所用试剂。本专利技术一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，其特殊之处在于该方法对12个血型抗原进行基因分型，并包括以下步骤：(1)制备基因分型样本的人基因组DNA；(2)提供扩增引物，用聚合酶链反应同管、同步扩增所述基因组DNA中5个血型系统12个抗原对应的基因序列；(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(4)提供测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物分别进行测序PCR反应，所述测序引物与步骤(2)相应的扩增引物相同；(5)将步骤(4)得到的测序反应产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其血型抗原基因型；步骤(2)中的扩增引物与步骤(4)中相应的测序引物相同，这些引物为：(1)Kell血型系统K、k抗原编码基因的扩增和测序引物：KEL-F:5’-GAGGGAGATGGAGATGGAAA-3’KEL-R:5’-GACTGGTGTGTGTGGAGAGG-3’(2)Duffy血型系统Fya、Fyb抗原编码基因的扩增和测序引物：FY-F:5’-TCCCCCTCAACTGAGAACTC-3’FY-R:5’-AAGGCTGAGCCATACCAGAC-3’(3)Duffy血型系统Fy(a-b-)无效表型(Fya和Fyb抗原均阴性)编码基因的扩增和测序引物：FYN-F:5’-CAAGGCCAGTGACCCCCATA-3’FYN-R:5’-CATGGCACCGTTTGGTTCAG-3’(4)Kidd血型系统Jka、Jkb抗原编码基因的扩增和测序引物：JK-F:5’-CTTTCAATCCCACCCTCAGT-3’JK-R:5’-CTCAATAGGCTCCTGCCTTC-3’(5)Dombrock血型系统Doa、Dob抗原编码基因的扩增和测序引物：DO1-F:5’-ACAGGGGCCACCATTCGATT-3’DO1-R:5’-TGTGCTCAGGTTCCCAGTTG-3’(6)Dombrock血型系统Hy、Joa抗原编码基因的扩增和测序引物：DO2-F:5’-ATCGACTTCGACTTCGCACC-3’DO2-R:5’-ACGTTCATACTGCTGTGGAG-3’(7)Colton血型系统Coa、Cob抗原编码基因的扩增和测序引物：CO-F:5’-AAGCTCTTCTGGAGGGCAGT-3’CO-R:5’-GACACCTTCACGTTGTCCTG-3’。进一步地，所述5个红细胞血型系统分别为Kell、Duffy、Kidd、Dombrock、Colton血型系统，其基因名称分别为KEL、ACKR1、SLC14A1、ART4、AQP1；所述12个抗原分别为K、k、Fya、Fyb、Jka、Jkb、Doa、Dob、Hy、Joa、Coa、Cob；所述K、k属于Kell血型系统，Fya、Fyb属于Duffy血型系统，Jka、Jkb属于Kidd血型系统，Doa、Dob、Hy、Joa属于Dombrock血型系统，Coa、Cob属于Colton血型系统。进一步地，所述步骤(3)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。本专利技术一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法所用的试剂，其特殊之处在于：所述试剂具有用于扩增5个血型系统基因的7对引物和用于测序的7对引物，所述用于扩增的引物和用于相应的测序的引物相同，这些引物为：(1)Kell血型系统K、k抗原编码基因的扩增和测序引物：KEL-F:5’-GAGGGAGATGGAGATGGAAA-3’KEL-R:5’-GACTGGTGTGTGTGGAGAGG-3’(2)Duffy血型系统Fya、Fyb抗原编码基因的扩增和测序引物：FY-F:5’-TCCCCCTCAACTGAGAACTC-3’FY-R:5’-AAGGCTGAGCCATACCAGAC-3’(3)Duffy血型系统Fy(a-b-)无效表型(Fya和Fyb抗原均阴性)编码基因的扩增和测序引物：FYN-F:5’-CAAGGCCAGTGACCCCCATA-3’FYN-R:5’-CATGGCACCGTTTGGTTCAG-3’(4)Kidd血型系统Jka、Jkb抗原编码基因的扩增和测序引物：JK-F:5’-CTTTCAATCCCACCCTCAGT-3’JK-R:5’-CTCAATAGGCTCCTGCCTTC-3’(5)Dombrock血型系统Doa、Dob抗原编码基因的扩增和测序引物：DO1-F:5’-ACAGGGGCCACCATTCGATT-3’DO1-R:5’-TGTGCTCAGGTTCCCAGTTG-3’(6)Dombrock血型系统Hy、Joa抗原编码基因的扩增和测序引物：DO2-F:5’-ATCGACTTCGACTTCGCACC-3’DO2-R:5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，其特征在于：所述方法对5个人类红细胞血型系统的12个抗原进行同步基因分型，所述方法包括以下步骤：(1)制备基因分型样本的人基因组DNA；(2)提供扩增引物，用聚合酶链反应同步扩增所述基因组DNA中5个血型系统12个抗原对应的基因序列；(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(4)提供测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物分别进行测序PCR反应；(5)将步骤(4)得到的测序反应产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其血型抗原基因型；步骤(2)中的扩增引物与步骤(4)中相应的测序引物相同，这些引物为：(1)Kell血型系统K、k抗原编码基因的扩增和测序引物：KEL‑F:5’‑GAG GGA GAT GGA GAT GGA AA‑3’KEL‑R:5’‑GAC TGG TGT GTG TGG AGA GG‑3’(2)Duffy血型系统Fya、Fyb抗原编码基因的扩增和测序引物：FY‑F:5’‑TCC CCC TCA ACT GAG AAC TC‑3’FY‑R:5’‑AAG GCT GAG CCA TAC CAG AC‑3’(3)Duffy血型系统Fy(a‑b‑)无效表型(Fya和Fyb抗原均阴性)编码基因的扩增和测序引物：FYN‑F:5’‑CAA GGC CAG TGA CCC CCA TA‑3’FYN‑R:5’‑CAT GGC ACC GTT TGG TTC AG‑3’(4)Kidd血型系统Jka、Jkb抗原编码基因的扩增和测序引物：JK‑F:5’‑CTT TCA ATC CCA CCC TCA GT‑3’JK‑R:5’‑CTC AAT AGG CTC CTG CCT TC‑3’(5)Dombrock血型系统Doa、Dob抗原编码基因的扩增和测序引物：DO1‑F:5’‑ACA GGG GCC ACC ATT CGA TT‑3’DO1‑R:5’‑TGT GCT CAG GTT CCC AGT TG‑3’(6)Dombrock血型系统Hy、Joa抗原编码基因的扩增和测序引物：DO2‑F:5’‑ATC GAC TTC GAC TTC GCA CC‑3’DO2‑R:5’‑ACG TTC ATA CTG CTG TGG AG‑3’(7)Colton血型系统Coa、Cob抗原编码基因的扩增和测序引物：CO‑F:5’‑AAG CTC TTC TGG AGG GCA GT‑3’CO‑R:5’‑GAC ACC TTC ACG TTG TCC TG‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种同步检测5个红细胞血型系统12个抗原的基因分型方法，其特征在于：所述方法对5个人类红细胞血型系统的12个抗原进行同步基因分型，所述方法包括以下步骤：(1)制备基因分型样本的人基因组DNA；(2)提供扩增引物，用聚合酶链反应同步扩增所述基因组DNA中5个血型系统12个抗原对应的基因序列；(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(4)提供测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物分别进行测序PCR反应；(5)将步骤(4)得到的测序反应产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其血型抗原基因型；步骤(2)中的扩增引物与步骤(4)中相应的测序引物相同，这些引物为：(1)Kell血型系统K、k抗原编码基因的扩增和测序引物：KEL-F:5’-GAGGGAGATGGAGATGGAAA-3’KEL-R:5’-GACTGGTGTGTGTGGAGAGG-3’(2)Duffy血型系统Fya、Fyb抗原编码基因的扩增和测序引物：FY-F:5’-TCCCCCTCAACTGAGAACTC-3’FY-R:5’-AAGGCTGAGCCATACCAGAC-3’(3)Duffy血型系统Fy(a-b-)无效表型(Fya和Fyb抗原均阴性)编码基因的扩增和测序引物：FYN-F:5’-CAAGGCCAGTGACCCCCATA-3’FYN-R:5’-CATGGCACCGTTTGGTTCAG-3’(4)Kidd血型系统Jka、Jkb抗原编码基因的扩增和测序引物：JK-F:5’-CTTTCAATCCCACCCTCAGT-3’JK-R:5’-CTCAATAGGCTCCTGCCTTC-3’(5)Dombrock血型系统Doa、Dob抗原编码基因的扩增和测序引物：DO1-F:5’-ACAGGGGCCACCATTCGATT-3’DO1-R:5’-TGTGCTCAGGTTCCCAGTTG-3’(6)Dombrock血型系统Hy、Joa抗原编码基因的扩增和测序引物：DO2-F:5’-ATCGACTTCGACTTCGCACC-3’DO2-R:5’-ACGTTCATACTGCTGTGGAG-3’(7)Colton血型系统Coa、Cob抗原编码基因的扩增和测序引物：CO-F:5’-AAGCTCTTCTGGAGGGCAGT-3’CO-R:5’-GACACCTTCACGTTGTCCTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱发明，许先国，应燕玲，洪小珍，陈舒，马开荣，何吉，
申请(专利权)人：浙江省血液中心，
类型：发明
国别省市：浙江,33