舞毒蛾FTZ‑F1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用，涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾FTZ‑F1基因、其编码蛋白及其应用。发明专利技术是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题。该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。本发明专利技术利用分子生物学手段干扰基因FTZ‑F1，使其表达下调，延长幼虫蜕皮周期，减缓其发育，甚至引起死亡。本发明专利技术提供的能够表达舞毒蛾FTZ‑F1基因的dsRNA的转化84K杨植株能够显著阻碍舞毒蛾成虫翅的伸展，影响成虫翅的发育和飞行能力。本发明专利技术用于舞毒蛾害虫防治领域。
【技术实现步骤摘要】
舞毒蛾FTZ-F1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及舞毒蛾FTZ-F1基因、其编码蛋白及其应用。
技术介绍
舞毒蛾是一种重要农林食叶害虫，在我国分布范围广泛、可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500多种植物，大爆发时可造成巨大的经济损失。目前，在舞毒蛾害虫的防治中依旧是化学防治占据着主要的地位，生物防治及物理防治通常只作为辅助防治方法。化学农药的长时间、高频率、使用量不断的增加，导致害虫出现抗药性、再增猖撅，以及农药残留等环境污染问题。化学农药使用后弊端的产生推动了新一代害虫防治研究的展开。分子生物学技术的快速发展，并使其被广泛应用于害虫的生理机制研究及防治，其中RNA干扰技术凭借其高效沉默、特异性强、操作简便、节省时间及实验规模较小等特点成为植物保护者通过沉默功能基因来进行害虫防治的重要手段。RNA干扰初期是通过体外合成的靶标基因dsRNA后，进行微量注射或直接喂食的方法将dsRNA导入进入昆虫淋巴液实施干扰。通过转基因植物特异表达靶标基因的dsRNA来实现RNA干扰的手段，不仅能很好的解决注射dsRNA造成的械损伤、喂食dsRNA产生的使用量及成本问题，而且促进将RNAi技术运用于自然界农林业害虫防治，转基因植物表达dsRNA成为防治害虫的研究热点。因此，为解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，采用生物学手段进行病虫害防治的研究至关重要。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有舞毒蛾的化学防治存在抗药性和污染环境的问题，提供一种舞毒蛾FTZ-F1基因、其编码蛋白及其dsRNA在害虫防治中的应用。本专利技术舞毒蛾FTZ-F1基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。本专利技术舞毒蛾FTZ-F1基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示。本专利技术舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA序列如序列表中SEQIDNO：4所示。本专利技术以舞毒蛾FTZ-F1基因片段为模板，并设计特异dsRNA引物对，通过MEGAscriptRNAi试剂盒(Ambion)合成FTZ-F1基因dsRNA。本专利技术还提供一种用于构建能够表达基因dsRNA的重组质粒的构建方法。构建干扰载体时，先将pHANNIBAL载体上的35S-PDK-OCS片段与pCAMBIA2300植物表达载体链接后形成能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体。本专利技术还提供一种能够表达舞毒蛾FTZ-F1基因片段序列的dsRNA的重组质粒的构建方法。将FTZ-F1目的片段分别正反向插入到pCAMBIA2300-PDK中间载体的PDK内含子的左右侧，形成以pCAMBIA2300载体为表达载体的干扰载体片段gene-PDK-gene，构建成能够表达FTZ-F1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒。FTZ-F1目的片段和pCAMBIA2300-PDK中间载体均含有KpnI--KpnI和XbaI--BamHI两组内切酶酶切位点。重组子具有可用于筛选的氨苄青霉素和卡那抗性基因。本专利技术还提供舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA在害虫防治中的应用。其中应用方法之一在于，将舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞毒蛾3龄幼虫体内。所述注射剂量为12μg。其中应用方法之二在于，将FTZ-F1目的片段插入到能够表达基因dsRNA的pCAMBIA2300-PDK中间载体中，形成干扰载体片段gene-PDK-gene，构建能够表达FTZ-F1dsRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组质粒，将含有FTZ-F1目的片段的pCAMBIA2300-gene-PDK-gene重组载体进行植物遗传转化，获得表达FTZ-F1dsRNA的转化植株。进一步的，所述植物为84K杨。本专利技术提供的能够表达舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA的转化84K杨植株能够显著阻碍舞毒蛾成虫翅的伸展，影响成虫翅的发育和飞行能力。本专利技术的有益效果：在脊椎动物体内发现，SF1是类固醇生成的关键调节因子，SF1能够提高与类固醇合成有直接或间接关联的基因的表达水平。SF1是由FTZ-F1基因编码生成的。在昆虫中发现，FTZ-F1能通过激发昆虫多种组织中的多个基因的表达来响应20-羟基蜕皮酮(20E)滴度变化，进行蜕皮激素自身合成的反馈调节和幼虫-蛹变态发育过程中的蜕皮激素信号转导。本专利技术利用分子生物学手段干扰舞毒蛾重要蜕皮发育相关基因FTZ-F1，使其表达下调，延长幼虫蜕皮周期，减缓其发育，甚至引起死亡。将FTZ-F1基因dsRNA注射入舞毒蛾3龄幼虫体内后，与对照处理相比，高效沉默了舞毒蛾的靶标基因FTZ-F1基因，致使舞毒蛾幼虫3龄蜕皮期延长，同时鲜重增长缓慢，累计死亡率达到76.67％，严重影响了舞毒蛾幼虫的正常生长发育。本专利技术进一步构建FTZ-F1dsRNA植物表达载体，并通过农杆菌介导法将其导入84K杨，获得表达FTZ-F1dsRNA的84K杨转化植株。舞毒蛾幼虫取食能够表达FTZ-F1dsRNA的转基因植株叶片后，蛹羽化后，成虫翅出现皱缩无力的畸型，阻碍其正常飞行。转基因植物表达FTZ-F1dsRNA为防治农林重要害虫舞毒蛾提供新方法与新材料。附图说明图1为注射dsRNA后舞毒蛾3龄幼虫FTZ-F1基因表达水平；图2为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫鲜重的影响；图3为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫龄期的影响；图4为FTZ-F1基因沉默对舞毒蛾幼虫存活率的影响；图5为35S-PDK-OCS序列扩增结果；其中M:2000bpDNAMarker；1-2:35S-PDK-OCSfragments；图6为载体pCAMBIA2300-PDKPCR序列扩增结果；其中M:2000bpDNAMarker；1-6:PCRfragments；图7为分别带有KpnI和XbaI/BamHIFTZ-F1的目的片段PCR序列扩增结果；其中M:2000bpDNAMarker；1:目的片段(P1178KpnIF/R)；2:目的片段(P1178XbaI-F/BamHI-R)；图8为用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段的正向插入PCR序列扩增结果；其中M:2000bpDNAMarker；1-5:PCRfragments(P1178-F/P1178-R)；图9为用于合成FTZ-F1dsRNA的目的片段的反向插入PCR序列扩增结果；其中M:2000bpDNAMarker；1-5:PCRfragments(P1178Check-F/PPHAN-SEQ-R)；图10为FTZ-F1dsRNA重组质粒酶切检测结果；其中M:2000bpDNAMarker；1:enzymedigestionbyKpnI；2:enzymedigestionbyXbaI—BamHI；图11为具有抗性的转基因植株；图12为PCR检测具有抗性的转化植株；其中M:2000bpDNAMarker；1～4:转化植株；图13为转基因84K杨对舞毒蛾雌性成虫羽化的影响；其中左图为对照雌虫，右图为处理雌虫；图14为转基因84K杨对舞毒蛾雄性成本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.舞毒蛾FTZ‑F1基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.舞毒蛾FTZ-F1基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，其编码区CDS的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。2.权利要求1所述舞毒蛾FTZ-F1基因的编码蛋白，其特征在于舞毒蛾FTZ-F1基因的编码区CDS编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示。3.权利要求1所述舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA序列，其特征在于dsRNA序列如序列表中SEQIDNO：4所示。4.舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA在害虫防治中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA用于害虫防治的具体方法为：将舞毒蛾FTZ-F1基因的dsRNA注射入饥饿12h后的舞...
【专利技术属性】
技术研发人员：王步勇，问荣荣，王娟，李莹莹，李秀伟，
申请(专利权)人：菏泽学院，
类型：发明
国别省市：山东,37
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