一种提高红曲色素产量的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高红曲色素产量的方法。该技术方案首先从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌基因敲除的双元质粒载体pHph0380。在此基础上，从红色红曲霉CICC41233中克隆得到糖转运蛋白gltp1基因上下游同源臂片段，与质粒载体pHph0380连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，构建得到了重组菌株。红曲色素发酵结果表明，本方法所构建的重组菌株，其红曲色素积累时间显著提前，且醇溶性色素产量得到明显提高，在发酵144h时，醇溶性色素产量较亲本菌株提高74％。本发明专利技术利用基因工程手段使红曲霉发酵产红曲色素的时间提前，提高了淀粉的利用率，提高了红曲色素的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种提高红曲色素产量的方法
本专利技术涉及工业微生物
，进一步涉及基因工程技术以及霉菌的发酵技术，具体涉及一种提高红曲色素产量的方法。
技术介绍
红曲色素是由微生物红曲霉菌(Monasusspp.)，以大米为原料发酵而成的天然色素，在我国有一千多年的历史。作为食品添加剂，红曲色素广泛应用于食品加工和化妆品制造等领域；因其还具有广泛的生物活性如调血脂、降血压、防血管硬化、抗糖尿病、抑制肥胖、抗炎症、抗过敏、防过氧化、抗癌、抗细菌、抗真菌等，它在益生保健产品开发和医疗领域的应用也越来越受到重视。红曲色素是红曲霉的次级代谢产物，由脂肪酸合成途径和聚酮合成途径共同完成合成代谢。其化学结构主要分为聚酮和脂肪酸链两部分。脂肪酸链的合成以乙酰CoA为前体，经脂肪酸合酶(Fattyacidsynthase，FAS)复合体作用，经过一系列合成反应形成中长链脂肪酸，其与乙酰CoA反应生成β-酮酸；聚酮的合成同样以乙酰CoA为前体，在聚酮合酶(Polyketidesynthase,PKS)作用下，依次合成多聚酮体化合物，最终形成带有生色基团的聚酮。聚酮的羧基基团与脂肪酸链的羟基基团发生酯化反应，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于包括以下步骤：1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将一对依次含有Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II酶切位点的寡核苷酸序列通过T4 DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；2)以质粒pMD19‑PgpdA‑hph‑TtrpC为模板，采用一对引物扩增得到hph表达盒片段，用限制性内切核酸酶Sac I与Xho I同时酶切所述hph表达盒片段以及双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4 ...

【技术特征摘要】
1.一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于包括以下步骤：1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶HindIII与BglII酶切，而后将一对依次含有HindIII、KpnI、SacI、PacI、PmeI、XhoI、XbaI、BglII酶切位点的寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；2)以质粒pMD19-PgpdA-hph-TtrpC为模板，采用一对引物扩增得到hph表达盒片段，用限制性内切核酸酶SacI与XhoI同时酶切所述hph表达盒片段以及双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒敲除载体pHph0380；3)以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，采用一对引物扩增出糖转运蛋白gltp1基因的上游同源臂片段；以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，采用另一对引物扩增出糖转运蛋白gltp1基因的下游同源臂片段；将所述上游同源臂片段和所述下游同源臂片段分别连接至所述载体pHph0380上，即得到双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP；4)将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入红色红曲霉菌株中，构建得到重组菌株；5)利用所述重组菌株发酵产红曲霉素。2.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于步骤1)中所述的一对依次含有HindIII、KpnI、SacI、PacI、PmeI、XhoI、XbaI、BglII酶切位点的寡核苷酸序列，分别如SEQIDNo:1、SEQIDNo:2所示。3.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于步骤2)中所述的一对引物分别为PgpdA-SacI-F和TtrpC-XhoI-R，其序列分别如SEQIDNo:3、SEQIDNo:4所示。4.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于步骤3)中所述的一对引物分别为Gltp-QC-UF-PstI和Gltp-QC-UR-SacI，其序列分别如SEQIDNo:9、SEQIDNo:10所示；所述糖转运蛋白gltp1基因的上游同源臂片段的长度为1740bp；步骤3)中所述的另一对引物分别为Gltp-QC-DF-BglII和Gltp-QC-DR-SpeI，其序列分别如SEQIDNo:11、SEQIDNo:12所示；所述糖转运蛋白gltp1基因的下游同源臂片段的长度为1764bp。5.根据权利要求1所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于步骤4)包括：制备感受态的根癌农杆菌EHA105，通过液氮冻融法将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉CICC41233中，筛选阳性克隆，即得到所述重组菌株。6.根据权利要求5所述的一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于所述通过液氮冻融法将所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒敲除载体pHph0380-GLTP加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1m...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙传南，曾斌，陶琴琴，刘心怡，刘梦梦，彭玲，程芳婷，王淑琴，吾蔚蔚，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36