一种AFFT1细胞制造技术

本申请涉及一种AFFT1细胞及其制备方法，将RFF细胞用TCR－T技术原理进行了改造，改造后的T细胞再用基因编缉技术对其进行免疫抑制靶点的敲除，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

【技术实现步骤摘要】
一种AFFT1细胞
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种AFFT1细胞及其制备方法。
技术介绍
目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL、等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGEA3抗原。以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。物异性精准多肽的二次刺激不如T细胞受体转导的肿瘤特异性抗原更直接。现有的TCR-T在治疗血液肿瘤和实体肿瘤的解决方案中，缺乏覆盖更多瘤种的精准的TCR。上述方案均没有考虑T细胞的自我防护技术，使得数量不多的特异性T细胞直接面对强大的免疫微环境。
技术实现思路
本专利技术将RFF细胞用TCR－T技术原理进行了改造，改造后的T细胞再用基因编缉技术对其进行免疫抑制靶点的敲除，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。对于专用名词的解释：A：永生化DC技术FF：混合多肽技术R：精准多肽二次冲击技术T：TCR-T技术1：靶点敲除防护技术AFFT1细胞改造方案1.全外显子测序1)使用人源外周血进行ctDNA测序或市售工程细胞系(如H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-25394T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞等)进行全外显子测序；2)利用软件对测序信息进行分析：一方面得到MHC类型信息；另一方面，将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；2.抗原表位预测1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan3.0、PickPocket、artificialneuralnetworks(ANN))，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为“抗原表位”；3.合成突变多肽多肽由技术服务公司进行合成；1)4.永生化DC1)抽取外周血100ml2)Ficol密度梯度离心分离PBMC3)美天旎树突状细胞分离试剂盒分离树突状细胞，重悬于培养基中。4)TAX-GFP慢病毒感染所分离的树突状细胞，37℃孵箱静止培养，观察5)待细胞克隆化生长后，挑选克隆于96孔板分别培养6)单克隆表型分析7)选取理想的克隆作为永生DC；5.永生DC负载突变多肽1)配制多肽溶液：采用步骤3合成的突变多肽进行配制，每条多肽的终浓度为10～100μg/mL，优选50μg/mL，备用；2)离心收集获得的永生DC，以配制的多肽溶液重悬，并置于细胞培养板中进行多肽负载；3)37℃5％CO2，冲击1～4h，优选4h，备用；6.负载突变多肽的DC与PBMC共孵育1)刺激因子OKM-25预铺板，40μLOKM-25+4mLPBS，2mL/皿(4.5cm2)室温4h，4℃备用；2)将负载突变多肽的DC与之前抽取的PBMC，以1：1～1：50的比例进行混合，优选1：10，并转移至预铺OMK25的细胞培养板或培养瓶中；3)晃匀，37℃5％CO2培养，记为第0天；4)观察共培养细胞情况，根据细胞密度，在第5天，将共培养细胞转移至大培养瓶中，补新鲜的培养液OKM-100+12％FBS，20mL于75cm2培养瓶中；5)共培养第7天，再加入20mL新鲜OKM-100+12％FBS；6)共培养第10天，培养液为OKM-200+5％FBS，将共培养细胞从75cm2瓶转移至175cm2大瓶中；具体转移方法：25mL培养液OKM-200+5％FBS吹打，再转入大瓶，重复2次；以培养液OKM-200+5％FBS补足至200mL。7)培养至14-21天时，即可获得AFF方案细胞。7.多肽作为抗原直接刺激T细胞筛选精准多肽：1)离心收集获得的AFF方案细胞，1500rpm离心5min收集T-cells，加入10mLPBS重悬细胞并计数，1500rpm离心5min，收集T-cells以1640+10％FBS+200U/mLIL2重悬，计数调整至1×106cells/mL；2)以排枪将T-cells分至96孔平底板中，200μL/孔，细胞数为2×105cells；再分别加入10μL1mg/mL的步骤3合成的突变多肽，终浓度为50μg/mL，每条多肽设置3复孔；3)设置阳性对照：T-cells+100ng/mLOKT3；阴性对照：1640+10％FBS+200U/mLIL2；两个T-cells对照作为本底释放检测，分别为第一次加T-cells，和最后一次加T-cells；以两个本底释放的差异作为系统误差；4)37℃、5％CO2刺激24h后，1500rpm离心10min，转移140μL上清至新的96孔板中；5)再将96孔板进行离心，1500rpm10min，取样品进行ELISA检测(或将样品至于-80℃保存)；8.精准多肽评判标准：1)阳性对照和阴性对照正常，则说明此数据可信；2)多肽作为抗原的以T-cells作为基线；3)每组实验为两个基线，高基线和低基线，两个基线的差异为系统误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+系统误差的，分别进行标注；检测值>高基线+系统误差即为有效的精准多肽；9.以筛选的精准多肽制备AFF细胞1)以方法4、5、6进行精准多肽AFF细胞的制备；10.突变抗原特异性杀伤T细胞的培养及分离：1)以多肽直接作为抗原刺激，对第9步获得的AFF细胞进行刺激，刺激12～72h后，备用；2)对刺激后的细胞进行CD8、CD137、IFN-γ的染色，并以流式细胞仪进行分选，选择CD8+CD137+、或者CD8+IFN-γ+细胞；11.CD8+T细胞TCR频率检测及高频TCR的克隆：1)分选得到细胞，立即进行基因组的提取；2)基因组进行TCR测序分析，根据TCR分布频率，确定高频的TCR序列；3)提取PBMC的mRNA，反转录成从DNA，根据高频TCR的序列，设计引物，扩增得到TCR基因；4)构建TCR基因表达载体，包装病毒；12.构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种AFFT1细胞，其特征在于，所述AFFT1细胞由以下步骤制备：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点；2)根据突变位点进行抗原表位预测，合成突变多肽；3)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，获得AFF细胞；4)用所述突变多肽作为抗原刺激所述AFF细胞，筛选获得精准多肽；5)以所述精准多肽负载DC细胞制备AFF’细胞；6)以所述精准多肽作为抗原刺激所述AFF’细胞，筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性细胞，通过测序得到特异性细胞的TCRβ链CDR3区序列，并将已知的一对TCRβ链CDR3区替换成所述CDR3序列；7)敲除所述患者外周血T细胞中原有的TCR基因和表面免疫抑制性信号分子，并转入步骤6)中获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，制备得到AFFT1细胞。

【技术特征摘要】
1.一种AFFT1细胞，其特征在于，所述AFFT1细胞由以下步骤制备：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点；2)根据突变位点进行抗原表位预测，合成突变多肽；3)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，获得AFF细胞；4)用所述突变多肽作为抗原刺激所述AFF细胞，筛选获得精准多肽；5)以所述精准多肽负载DC细胞制备AFF’细胞；6)以所述精准多肽作为抗原刺激所述AFF’细胞，筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性细胞，通过测序得到特异性细胞的TCRβ链CDR3区序列，并将已知的一对TCRβ链CDR3区替换成所述CDR3序列；7)敲除所述患者外周血T细胞中原有的TCR基因和表面免...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，周子珊，解佳森，陈小彬，陈红利，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11