一种耦合发酵制备海藻糖的方法技术

本发明专利技术涉及一种耦合发酵制备海藻糖的方法。本发明专利技术通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽PhoD同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC以及麦芽糖转运蛋白基因EIICB后，构建获得重组工程菌pHT01‑P43‑PhoD‑treS(LM12345)，通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。

【技术实现步骤摘要】
一种耦合发酵制备海藻糖的方法
本专利技术涉及一种耦合发酵制备海藻糖的方法，属于基因工程和发酵工程

技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubttlis)是原核生物研究领域中的重要模式菌，人们对其遗传背景和生理特征的了解仅次于大肠杆菌(Escherichiacoli)。枯草芽孢杆菌是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。该宿主的优点是：公认的安全菌株，分泌表达，无明显的密码子偏爱性；生长快，易培养，表达量高，遗传背景清楚以及分子操作简单的特点，且适合工程菌株改造等显著优势。基因工程中，信号肽是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。信号肽的选择及其成熟蛋白的融合，信号肽的功能在于引导前体蛋白与易位复合体结合并调节前体蛋白的折叠，在对蛋白分泌过程中起着重要作用。信号肽是一类具有15～60个氨基酸的多肽，一般定位于分泌蛋白的N端。一般是将编码目的蛋白的基因序列克隆至信号肽的C端，从而在宿主菌中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合。信号肽引导整个多肽链与胞内分子伴侣或者分泌信号识别位点的结合，进而跨膜转运至胞外。因此。研究不同种类的信本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耦合发酵制备海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用引物对P43‑F/P43‑PhoD‑R、PhoD‑P43‑F/PhoD‑TreS‑R进行PCR扩增，分别制得P43基因片段、PhoD基因片段；以TreS基因为模板，用引物对TreS‑PhoD‑F/TreS‑R进行PCR扩增，制得长度为2067bp的treS片段；通过重叠PCR连接P43基因片段、PhoD基因片段和treS片段，制得P43‑PhoD‑treS基因片段；所述引物对的核苷酸序列分别如下：P43‑F：CGCGGATCCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为BamHI酶切位点P43...

【技术特征摘要】
1.一种耦合发酵制备海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用引物对P43-F/P43-PhoD-R、PhoD-P43-F/PhoD-TreS-R进行PCR扩增，分别制得P43基因片段、PhoD基因片段；以TreS基因为模板，用引物对TreS-PhoD-F/TreS-R进行PCR扩增，制得长度为2067bp的treS片段；通过重叠PCR连接P43基因片段、PhoD基因片段和treS片段，制得P43-PhoD-treS基因片段；所述引物对的核苷酸序列分别如下：P43-F：CGCGGATCCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为BamHI酶切位点P43-PhoD-R：CTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA；PhoD-P43-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGG；PhoD-TreS-R：CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG；TreS-PhoD-F：GGCCTTTGAAGTAATGACCCAGCCCGACCC；TreS-R：GACGTCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAAACATGCCCGCTGCTGT；下划线为AatII酶切位点；(2)将步骤(1)制得的P43-PhoD-treS基因片段插入载体pHT01，制得pHT01-P43-PhoD-treS重组载体；(3)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，所述基因EIICB的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、-ΔSkfA、-ΔLytC、-ΔSdpC、-ΔEIICB，然后将敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC、pMAD-ΔEIICB分别转化B.subtilisWB800n感受态细胞，制得重组菌LM12345；(4)将步骤(2)制得的pHT01-P43-PhoD-treS重组载体转化步骤(3)制得的重组菌LM12345的感受态细胞，制得自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS；(5)将步骤(4)制得的自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS经种子培养、扩大培养后，按3～5％的体积百分比接种至发酵培养基中，在温度35～38℃，转速350～500rpm，发酵培养56～72h，发酵5～8h后，开始流加混合糖液，发酵结束，经纯化，制得含有海藻糖的发酵液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，P43基因片段为经过密码子优化的序列，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；PhoD基因片段为经过密码子优化的序列，核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王腾飞，王希晖，刘洪玲，杨少杰，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37