本发明专利技术提供一种靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列，其核苷酸序列是：5’‑TTGGGCATGTGTATATATAAA‑3’。本发明专利技术根据siRNA设计原则，选择的siRNA的cDNA序列GC含量为28.6％。构建靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA慢病毒载体，进行慢病毒包装后感染人巨细胞病毒潜伏感染的细胞模型，能有效降低lncRNA4.9的核酸水平，可应用于体内外人巨细胞病毒lncRNA4.9及其调控蛋白的功能研究。
SIRNA sequence targeting human cytomegalovirus lncRNA 4.9 and its application
The present invention provides a siRNA sequence targeting human cytomegalovirus lncRNA 4.9, whose nucleotide sequence is: 5'TTGGCATGTATATATAAA 3'. According to the design principle of siRNA, the GC content of the selected siRNA gene sequence is 28.6%. The siRNA lentivirus vector targeting human cytomegalovirus lncRNA 4.9 was constructed, and the cell model of latent infection of human cytomegalovirus after packaging with lentivirus could effectively reduce the level of nucleic acid of lncRNA 4.9, which could be used to study the function of human cytomegalovirus lncRNA 4.9 and its regulatory protein in vivo and in vitro.
【技术实现步骤摘要】
靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列及其应用
本专利技术属生物技术，涉及分子生物学和基因工程
，具体涉及靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列的设计、筛选以及在体内外研究lncRNA4.9及其调控蛋白功能中的应用。
技术介绍
人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒科β属的双链DNA病毒，其感染在人群中极为普遍，成年人血清抗体阳性率高达90％以上。原发性HCMV感染大多呈无症状的隐性感染，病毒可长期潜伏在体内，甚至终生带毒，但在免疫功能缺陷人群中潜伏的HCMV可被激活而引起严重疾病。HCMV还可通过胎盘、产道、母乳等途径在母婴间传播，是目前公认的引起先天性感染最常见的病原体，先天性感染的发生率约占活产儿的0.2％-2.2％。先天性HCMV感染不仅会造成流产、死胎、胎儿畸形、宫内发育迟缓等严重后果，在无症状感染患儿中导致的迟发性后遗症也不容忽视。据报道，约5％至17％的无症状先天性HCMV感染患儿在出生后表现出不同程度的神经系统后遗症，包括感觉神经性耳聋、智力发育延迟、运动障碍、癫痫、视网膜脉络膜炎等。长链非编码RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一类长度＞200nt且不表现任何蛋白质编码潜能的非编码RNA。越来越多的研究表明，lncRNA参与了细胞生理、病理的各个过程。目前已知lncRNA的作用方式有两种：①转录水平的调控，如lncRNA可以识别、结合到靶基因的基因组功能区(启动子区、增强子区等)，并招募某些功能蛋白来调控靶基因的表达；②转录后水平的调控，即lncRNA也可与转录产物通过碱基互补配对结合，从而影响靶基因转录产物的剪切、拼接及翻译。目前已知参与HCMV感染过程的病毒lncRNA主要包括lncRNA1.2、lncRNA2.7、lncRNA4.9和lncRNA5.0，部分lncRNA的调控作用已获得证实，如lncRNA2.7可通过与线粒体酶复合物结合而抑制细胞凋亡，lncRNA5.0与HCMV的毒力有密切关系。lncRNA4.9直到最近才从HCMV表达谱中被确认，其转录本长度为4922bp。研究发现，HCMV增殖感染72小时后才能检测到lncRNA4.9，且lncRNA4.9在HCMV增殖感染过程中维持低水平；而在HCMV潜伏感染的细胞中则可检测到高水平的lncRNA4.9，抑制lncRNA4.9后潜伏感染的HCMV会被激活。免疫共沉淀研究进一步揭示，lncRNA4.9可与多聚抑制复合物作用，并识别和结合在HCMV即刻早期基因IE2的启动子区，抑制IE2的转录，推测lncRNA4.9可能通过调控IE2的表达水平参与HCMV的潜伏感染。但迄今为止lncRNA4.9的确切作用机制，及其调控靶蛋白的种类和功能仍有待进一步研究。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是序列特异的双链RNA使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。RNAi的作用主要由长约21～23nt的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)介导，由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的siRNA作用靶点。RNAi靶点的选择原则主要包括：①从靶基因起始密码子下游50～100nt开始查找；②选择GC含量在25％-65％左右的mRNA区域；③避免连续的单一碱基和反向重复序列；④保证靶序列与其他基因没有同源性。制备siRNA的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNaseⅢ降解法、siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。目前，RNAi已在HIV、HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要进展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向HCMVlncRNA4.9的有效siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-TTGGGCATGTGTATATATAAA-3’。本专利技术的另一个目的是提供该cDNA序列在体内外研究lncRNA4.9及其调控蛋白功能中的应用。本专利技术根据siRNA设计原则，选择的siRNA的cDNA序列GC含量为28.6％。构建靶向HCMVlncRNA4.9的siRNA慢病毒载体，进行慢病毒包装后感染HCMV潜伏感染的细胞模型，能有效降低lncRNA4.9的核酸水平，可应用于体内外HCMVlncRNA4.9及其调控蛋白的功能研究。本专利技术的有益之处是：提供的siRNA序列靶向HCMV的长链非编码RNA4.9，目前国内外尚无用siRNA表达载体法筛选HCMVlncRNA4.9有效siRNA序列的报道。携带此序列的慢病毒在细胞中能持续、有效抑制lncRNA4.9的核酸水平，有助于深入研究lncRNA4.9及其调控蛋白的具体功能。具体实施方式本专利技术结合实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术的范围。实施例1siRNA体外抑制HCMVlncRNA4.9的核酸水平1.siRNA的设计：根据siRNA设计原则，从lncRNA4.9转录本起始位置下游100nt处搜索NA序列，其3’端相邻21nt序列作为候选靶点，并选择GC含量在25～65％的siRNA序列，通过GenBank数据库的Blast功能与人类基因组序列进行比对，确保无同源性。最终选择的siRNA其cDNA序列为5’-TTGGGCATGTGTATATATAAA-3’，GC含量为28.6％。2.表达siRNA所需双链DNA的合成与制备：表达siRNA所需双链DNA的正义链序列为5’-CCGGTTGGGCATGTGTATATATAAACTCGAGTTTATATATACACATGCCCAATTTTTG-3’，反义链序列为5’-AATTCAAAAATTGGGCATGTGTATATATAAACTCGAGTTTATATATACACATGCCCAA-3’，委托生物公司合成，将正、反义链分别退火形成双链。3.siRNA慢病毒载体的构建和包装：慢病毒载体GV248用AgeI和EcoRI双酶切，与退火后的双链DNA连接，转化感受态细胞，37℃培养过夜，挑取阳性克隆抽提质粒送生物公司进行DNA测序鉴定，选取测序结果正确的载体扩增、保存。将构建的siRNA慢病毒载体与病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，转染72h后进行慢病毒的收获、浓缩与纯化，最终获得的慢病毒滴度约为2×109TU/ml。4.siRNA体外抑制lncRNA的核酸水平：(1)HCMV潜伏感染细胞模型：HCMVTowne株以MOI＝5感染人急性单核白血病细胞THP-1，构建HCMV潜伏感染的细胞模型。(2)siRNA慢病毒感染HCMV潜伏感染模型：将靶向lncRNA的siRNA慢病毒以MOI＝30感染HCMV潜伏感染细胞，同时以感染GV248空载体慢病毒的HCMV潜伏感染细胞作为阴性对照组。(3)荧光定量RT-PCR检测THP-1细胞中lncRNA4.9的核酸水平：慢病毒感染后72h收集THP-1细胞，Trizol法抽提细胞总RNA，采用TAKARA公司的SYBRPrimeScriptRT-RCPKit检测病毒lncRNA4.9，实验方法参照试剂盒说明书。l本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列，其核苷酸序列是：5’‑TTGGGCATGTGTATATATAAA‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种靶向人巨细胞病毒lncRNA4.9的siRNA序列，其核苷酸序列是：5’-TTGGGCATGTGTATAT...
【专利技术属性】
技术研发人员：尚世强，舒强，陶然，李伟，李华美，刘丽芳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。