包含胰岛样细胞团的制剂制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，尤其涉及包含胰岛样细胞团的制剂。本发明专利技术提供了包含胰岛样细胞团的制剂及其制备方法，该制剂可降解，在显微镜下可见微球形态完整，粒径分布均匀。将该微球在体外培养，可发现微囊内干细胞扩增，并开始逐渐形成胚体类组织形态，同时进行检测，可在囊体外培养基检测到Pdx‑1‑Linker‑IGF‑1和胰岛素存在，证明该细胞逐渐向类胰腺组织演变并可以释放胰岛素，其最终可用于体内移植修复胰岛功能。

Preparations Containing Islet-like Cell Clusters

The invention relates to the field of biomedical technology, in particular to preparations containing islet-like cell mass. The invention provides a preparation comprising islet-like cell mass and a preparation method thereof. The preparation is degradable, and the microspheres have complete morphology and uniform particle size distribution under a microscope. The microspheres could be cultured in vitro to detect the proliferation of stem cells in microcapsules and begin to form embryoid tissue morphology gradually. At the same time, the presence of Pdx_1_Linker_IGF_1 and insulin could be detected in the culture medium in vitro. It proved that the microspheres gradually evolved into pancreas-like tissue and could release insulin, which could eventually be used for in vivo transplantation to repair the function of islets.

【技术实现步骤摘要】
包含胰岛样细胞团的制剂
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及包含胰岛样细胞团的制剂。
技术介绍
糖尿病(DiabetesMellitus,DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。据世界卫生组织推荐的分型，可将糖尿病分为以胰岛素绝对不足为主的I型糖尿病和以胰岛素相对不足且胰岛素抵抗为主的II型糖尿病两种类型。其中，约10％的患者属于I型糖尿病，遗传因素在该型糖尿病中的重要性高达50％，发病常见于儿童和青少年人群。另外，90％的患者属于II型糖尿病，是一种多基因遗传因素、环境因素联合作用引起的代谢性疾病，具有很高的遗传倾向，多见于40岁以上的成年患者。目前在糖尿病的临床治疗上，通过注射胰岛素来控制血糖虽然是一种有效的缓解措施，但并不能彻底治愈糖尿病，还有可能造成低血糖等风。真正根治糖尿病将是恢复机体内功能性胰岛β细胞的数量和消除糖尿病引发的各种并发症。其中，进行胰岛移植是治疗I型糖尿病和部分II型糖尿病最有效的方法之一。但是，由于供体来源严重不足以及器官移植将面临终身免疫抑制治疗等问题，极大地限制了胰岛移植在临床治疗上的广泛应用。近年来，由干细胞体外定向诱导分化成胰腺祖细胞和功能性胰岛来进行移植，为我们提供了一个全新的细胞替代疗法。但是，目前细胞在体内的修复效果欠佳，尚无法满足临床的应用。因此，应进一步研究，提高胰岛样细胞团在体内的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供包含胰岛样细胞团的制剂，该制剂具有良好的体内移植修复胰岛的功能。本专利技术提供了包含胰岛样细胞团的制剂的制备方法，包括：步骤1：将壳聚糖溶解于乙酸溶液，灭菌制得壳聚糖溶液；将胶原蛋白溶解于乙酸溶液，灭菌制得胶原蛋白溶液；步骤2：将壳聚糖溶液与胶原蛋白溶液混合，以京尼平为交联剂进行交联制得降解材料；步骤3：将降解材料与胰岛样细胞团混合，然后与含有乳化剂的植物油混合，加入固化剂于0～4℃搅拌2～5min，然后升温至35～40℃固化20～30min，制得所述制剂。本专利技术实施例中，所述壳聚糖为90％脱乙酰化的低分子量壳聚糖。本专利技术实施例中，所述壳聚糖溶液中，乙酸的质量分数为1％，壳聚糖的质量分数为1％。本专利技术实施例中，所述壳聚糖溶液的灭菌为高温灭菌，120℃灭菌20min。本专利技术实施例中，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白。本专利技术实施例中，所述胶原蛋白溶液中，乙酸的质量分数为1％，胶原蛋白的质量分数为3％。本专利技术实施例中，所述胶原蛋白溶液的灭菌为高温灭菌，120℃灭菌20min。本专利技术实施例中，步骤2中所述壳聚糖溶液与胶原蛋白溶液的体积比为1:1。本专利技术实施例中，所述京尼平与壳聚糖溶液的质量-体积比为1g:100mL；所述交联的条件为常温反应1小时。本专利技术实施例中，步骤3中所述胰岛样细胞团在降解材料中的密度为1×106cell/mL。本专利技术实施例中，所述乳化剂为Span80，在植物油中的质量分数为15％。本专利技术实施例中，所述固化剂为京尼平，在植物油中的质量分数为1％。本专利技术实施例中，加入固化剂后，0℃搅拌3min，然后升温至37℃固化25min。本专利技术实施例中，所述固化后还包括离心取沉淀、生理盐水清洗的步骤。一些实施例中，所述离心的条件为200g，5min。一些实施例中，所述生理盐水清洗的次数为3次。本专利技术实施例中，所述胰岛样细胞团由骨髓干细胞诱导分化制得。本专利技术实施例中，所述骨髓干细胞为表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的骨髓干细胞；所述诱导分化的培养基为含有30mmol/L葡萄糖和10mmol/LC肽的完全培养基。表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的骨髓干细胞的制备方法，其以慢病毒感染骨髓干细胞获得。所述慢病毒由含有表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的DNA分子的质粒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞构建获得。所述慢病毒包装质粒为pMD2G(表达VSVG包膜蛋白)和pCMVR8.74(表达HIV-1Gag,Pol,TatandRev蛋白)。所述共转染采用CaCl2转染。所述慢病毒的制备方法为：将293T细胞与本专利技术所述的质粒载体和pMD2G、pCMVR8.74质粒混合，以含有CaCl2的HeBS缓冲液，37℃，5％CO2培养后收集上清液，经过滤、离心收集病毒。所述感染为：将病毒悬液和完全培养基混合后加入含有干细胞的培养皿中，37℃孵育。4小时后，再加入一定量的完全培养基，37℃孵育，继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，继续培养获得所述干细胞。本专利技术制备方法制得的包含胰岛样细胞团的制剂。本专利技术制备方法制得的包含胰岛样细胞团的制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用。本专利技术还提供了一种糖尿病的制备方法，其为给予本专利技术提供的包含胰岛样细胞团的制剂。本专利技术提供了包含胰岛样细胞团的制剂及其制备方法，该制剂可降解，在显微镜下可见微球形态完整，粒径分布均匀。将该微球在体外培养，可发现微囊内干细胞扩增，并开始逐渐形成胚体类组织形态，同时进行检测，可在囊体外培养基检测到Pdx-1-Linker-IGF-1和胰岛素存在，证明该细胞逐渐向类胰腺组织演变并可以释放胰岛素，其最终可用于体内移植修复胰岛功能。附图说明图1示微球的显微镜检测结果；图2示10天内胰岛素分泌量检测结果；图3示10天干细胞转化效率结果；图4示10天干细胞成团效率结果；图5示10天干细胞成团的组织形态。具体实施方式本专利技术提供了包含胰岛样细胞团的制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例11、质粒制备：人工合成SEQIDNO:2所示的DNA片段，以BamHI，SalI，酶切位点BamHI：G^GATCC，4021，SalI：G^TCGAC，4049位点连接入载体pRRLSIN.cPPT.PGK-WPRE，构建获得表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的质粒载体(全序列如SEQIDNO:3所示)。2、病毒制备：A：293T细胞使用含10％FBS，+penicillin-streptomycin抗生素的DMEM培养基(完全培养基)进行培养，按15ml培养皿为例，加入8×106细胞，22.5ml完全培养基，37℃，5％CO2进行培养。B：过夜培养后，更换为无血清培养基DMEM。C：按一定比例将3个质粒(pMD2G、pCMVR8.74、pRRLSIN.cPPT.PGK-WPRE-Pdx-1-Linker-IGF-1)进行混合，缓冲液为HeBS。D：转染方法采用CaCl2转染方案，将CaCl2按一定比例和含有3质粒的HeBS缓冲液混合，充分混匀后，加入到293T培养皿中，37℃，5％CO2进行培养。E：过夜培养后，将培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含胰岛样细胞团的制剂的制备方法，包括：步骤1：将壳聚糖溶解于乙酸溶液，灭菌制得壳聚糖溶液；将胶原蛋白溶解于乙酸溶液，灭菌制得胶原蛋白溶液；步骤2：将壳聚糖溶液与胶原蛋白溶液混合，以京尼平为交联剂进行交联制得降解材料；步骤3：将降解材料与胰岛样细胞团混合，然后与含有乳化剂的植物油混合，加入固化剂于0～4℃搅拌2～5min，然后升温至35～40℃固化20～30min，制得所述制剂。

【技术特征摘要】
1.包含胰岛样细胞团的制剂的制备方法，包括：步骤1：将壳聚糖溶解于乙酸溶液，灭菌制得壳聚糖溶液；将胶原蛋白溶解于乙酸溶液，灭菌制得胶原蛋白溶液；步骤2：将壳聚糖溶液与胶原蛋白溶液混合，以京尼平为交联剂进行交联制得降解材料；步骤3：将降解材料与胰岛样细胞团混合，然后与含有乳化剂的植物油混合，加入固化剂于0～4℃搅拌2～5min，然后升温至35～40℃固化20～30min，制得所述制剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖为90％脱乙酰化的低分子量壳聚糖；所述壳聚糖溶液中，乙酸的质量分数为1％，壳聚糖的质量分数为1％；所述胶原蛋白为I型胶原蛋白；所述胶原蛋白溶液中，乙酸的质量分数为1％，胶原蛋白的质量分数为3％。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述壳聚糖溶液与胶原蛋白溶液的体积比为1:1。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述京尼平与壳聚糖溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立坚，赵钢，王竑婷，
申请(专利权)人：长春万成生物电子工程有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22