一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法技术

本发明专利技术是一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，通过种子消毒、种子培养、烟草外植体预培养、发根农杆菌培养、侵染与共培养、清洗与发状根培养、发状根愈伤组织培养、分化芽培养、再生植株生根培养等步骤完成。本发明专利技术针对烟草品种红花大金元，利用发根农杆菌，通过调节植物激素比例，提高其外植体产生愈伤组织比率，可将烟草组织培养产生新植株的时间缩短至2个月并提高组培苗的生产率。另外，经过分化芽培养步骤，能大大提高分化芽的生根率和存活率。

A Method of Inducing Hairy Root and Plant Regeneration of Safflower Dajinyuan

The invention relates to a method for inducing hairy root and plant regeneration of Safflower Dajinyuan, which is accomplished by seed disinfection, seed culture, tobacco explant pre-culture, Agrobacterium rhizogenes culture, infection and co-culture, cleaning and hairy root culture, callus culture of hairy root, differentiation bud culture and rooting culture of regenerated plant. The invention aims at tobacco variety Safflower Dajinyuan. By using Agrobacterium rhizogenes, by adjusting the proportion of plant hormones and increasing the ratio of callus production from explants, the time for tobacco tissue culture to produce new plants can be shortened to 2 months and the productivity of tissue culture seedlings can be improved. In addition, the rooting rate and survival rate of differentiated buds can be greatly improved by the steps of differentiation bud culture.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法
本专利技术属于植物细胞工程
，具体地说是一种发根农杆菌诱导烟草品种红花大金元外植体产生毛状根，并完成植株再生的方法。
技术介绍
发根农杆菌是根瘤菌科（Rhizobiaceae）农杆菌属（agrobacterium）的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。Ri质粒是一种具有侵染性的大质粒，位于发根农杆菌染色体外。在实验室条件下，发根农杆菌可以侵染人为划伤的外植体伤口，以使Ri质粒上的T-DNA中含有的rolB基因能够插入植物细胞核特定的基因当中，在宿主细胞内借助植物本身的DNA复制完成自身的复制与表达，合成特定的蛋白，从而诱导植株产生发状根。发根农杆菌诱导植物细胞产生发状根不仅能在无外源激素的培养基上快速自主生长，而且具有易通过组织培养途径获得再生植株等优势。ATCC15834发根农杆菌菌株来源于ATCC（美国模式培养物集存库/Americantypeculturecollection），为发根农杆菌原始菌株（wildstrain），含有pRi15834农杆碱型Ri质粒，具有广泛的寄主范围（禾本科、豆科、烟草等）。Ar.Qual发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（玉米、烟草、番茄、柑橘等），同时具有链霉素、氯霉素抗性。MSU440发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（玉米、烟草、茶树、青蒿等），同时具有链霉素抗性。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi12659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的寄主范围（葫芦科、豆科、茄科等），同时具有链霉素抗性。目前已有许多利用发根农杆菌诱导或转化烟草的相关研究，然而，针对不同品种烟草的培养条件和步骤仍需探索改进，筛选合适的培养基和培养条件能有效提高获得再生植株的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种发根农杆菌诱导烟草红花大金元产生发状根及植株再生的方法。本专利技术的技术方案如下：一种利用不同发根农杆菌菌种诱导烟草红花大金元产生发状根及植株再生的方法，包括如下步骤：步骤（1），红花大金元种子消毒；步骤（2），种子培养，将步骤（1）中消毒的种子接种到MS培养基中，待发芽长成幼苗；种子发芽培养条件：温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d，培养60d；步骤（3），烟草外植体预培养，将步骤（2）中得到的幼苗，利用手术刀将烟草叶片切成1cm2左右的叶盘，将叶盘置于MS培养基中进行预培养，培养条件为：25℃，黑暗培养3d；步骤（4），发根农杆菌培养，发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取发根农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600=0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600=0.6-0.8，供感染使用，步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；步骤（6），清洗与发状根培养，将步骤（5）中共培养3d的叶盘取出，用含有250mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗，在灭菌滤纸上吸干水分，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行发根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14d；步骤（7），发状根愈伤组织培养，将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，约1-1.5cm长，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14-21d，每10d更换培养基；步骤（8），分化芽培养，将步骤（7）中已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，10d；步骤（9），再生植株生根培养，将步骤（8）中分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，7-10d。进一步地，步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1%AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。进一步地，步骤（2）、（3）、（4）、（5）中，MS培养基的制备方法如下：MS基本培养基中添加30g/L蔗糖，固体培养基中添加4g/L琼脂，pH值为5.7。进一步地，步骤（4）中YEB培养基的制备方法如下：牛肉膏粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，固体培养基添加15g/L琼脂；可选用的发根农杆菌菌种有：ATCC15834、Ar.Qual、MSU440和K599，用于培养菌种Ar.Qual、K599和MSU440的YEB培养基需添加链霉素50mg/L。进一步地，步骤（6）、（8）、（9）中的MS培养基的制备方法如下：MS基本培养基中添加30g/L蔗糖，4g/L琼脂，pH值为5.7，添加羧苄青霉素250mg/L。进一步地，步骤（7）中的MS培养基的制备方法如下：所述MS培养基为MS基本培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂4g/L，pH为5.7，121℃灭菌15min，冷却到不烫手时，添加(A)、萘乙酸（NAA）0.5mg/L、6-苄基嘌呤（6-BA）2mg/L和250mg/L羧苄青霉素，摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后制成激素比例为1：4的培养基；或添加（B）、萘乙酸（NAA）0.2mg/L、6-苄基嘌呤（6-BA）2mg/L和250mg/L羧苄青霉素，摇匀后在100mm培养皿中倒入30mL培养基，冷却后制成激素比例为1：10的培养基。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术针对烟草品种红花大金元，利用发根农杆菌，通过调节植物激素比例，提高其外植体产生愈伤组织比率，可将烟草组织培养产生新植株的时间缩短至2个月并提高组培苗的生产率。另外，经过分化芽培养步骤，能大大提高分化芽的生根率和存活率。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1本实施例是基于发根农杆菌诱导烟草红花大金元产生发状根并植株再生的方法，包括如下步骤：步骤（1），红花大金元种子消毒：取饱满的红花大金元种子，在超近工作台中，用75%酒精清洗种子30s，水清洗2次，再用1%本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1），红花大金元种子消毒；步骤（2），种子培养，将步骤（1）中消毒的种子接种到MS培养基中，待发芽长成幼苗；种子发芽培养条件：温度25±1℃，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d，培养60d；步骤（3），烟草外植体预培养，将步骤（2）中得到的幼苗，利用手术刀将烟草叶片切成1cm2左右的叶盘，将叶盘置于MS培养基中进行预培养，培养条件为：25℃，黑暗培养3d；步骤（4），发根农杆菌培养，发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2‑3d，挑取发根农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5‑1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6‑0.8，供感染使用；步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；步骤（6），清洗与发状根培养，将步骤（5）中共培养3d的叶盘取出，用含有250mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗，在灭菌滤纸上吸干水分，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行发根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14d；步骤（7），发状根愈伤组织培养，将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，约1‑1.5cm长，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14‑21d，每10d更换培养基；步骤（8），分化芽培养，将步骤（7）中已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2‑4cm高，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，10d；步骤（9），再生植株生根培养，将步骤（8）中分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30‑50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，7‑10d。...

【技术特征摘要】
1.一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1），红花大金元种子消毒；步骤（2），种子培养，将步骤（1）中消毒的种子接种到MS培养基中，待发芽长成幼苗；种子发芽培养条件：温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d，培养60d；步骤（3），烟草外植体预培养，将步骤（2）中得到的幼苗，利用手术刀将烟草叶片切成1cm2左右的叶盘，将叶盘置于MS培养基中进行预培养，培养条件为：25℃，黑暗培养3d；步骤（4），发根农杆菌培养，发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取发根农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600=0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600=0.6-0.8，供感染使用；步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；步骤（6），清洗与发状根培养，将步骤（5）中共培养3d的叶盘取出，用含有250mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗，在灭菌滤纸上吸干水分，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行发根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14d；步骤（7），发状根愈伤组织培养，将步骤（6）中从叶盘边缘长出的发状根切下，约1-1.5cm长，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基中进行分化愈伤组织培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，14-21d，每10d更换培养基；步骤（8），分化芽培养，将步骤（7）中已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，10d；步骤（9），再生植株生根培养，将步骤（8）中分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，7-10d。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾婉俐，蒋佳芮，许力，向海英，高茜，宋春满，邓乐乐，杨文武，张建铎，李雪梅，张承明，杨光宇，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53