一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法技术

本发明专利技术属于医学检测领域并公开了一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法；该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS‑生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS‑AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液；本发明专利技术试剂盒具有特异性强、稳定性好的有益效果，提高了检测的灵敏度和特异性、适于自动化操作；本发明专利技术制备方法简单、容易在工业化生产中实现，有利于提高制备效率；同时，本发明专利技术检测方法检测过程简单，大大简化了现有的检测步骤和程序。

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法
本专利技术涉及医学检测
，尤其涉及一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法。
技术介绍
胰岛素是胰岛β细胞分泌的多肽激素，由51个氨基酸组成。胰岛素分泌人血后在体内的半衰期通常为3-5分钟，主要由肝脏摄取并降解，少量在近曲小管内重吸收和降解。葡萄糖是促进胰岛素分泌的最强刺激因子，在葡萄糖作用下健康人体中胰岛素呈双相脉冲式分泌。许多其他因素，如代谢性、内分泌性、神经性因素以及药物都可以影响胰岛素的合成和分泌。胰岛素在体内的合成代谢中具有重要作用，对体内几乎所有的组织都有直接或者间接的影响。在代谢中胰岛素与胰岛素受体结合产生胰岛素样作用，促进机体对糖、脂肪及蛋白质的合成和储存。增高：见于肝硬化、2型糖尿病、甲状腺功能亢进、肢端肥大症、营养不良型肌强直、胰腺增生导致的低血糖症；部分氨基酸、胰高血糖素、睾酮、生长激素及口服避孕药可使血中胰岛素增高。减低：见于1型糖尿病、部分2型糖尿病、垂体功能低下症、肾上腺皮质功能低下、继发性胰腺损伤和慢性胰腺炎；儿茶酚胺、β受体阻滞剂及利尿剂可使胰岛素水平减低。目前，胰岛素的实验室检测方法主要有有放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)、化学发光免疫(CLIA)等。其中RIA和ELISA出现较早，但由于其存在污染性强、灵敏度低、检测时间长等缺点，已不再据主体地位。而化学发光免疫技术由于灵敏度高、动力学范围宽、适于自动化操作等优点，是目前公认的特异性和灵敏度较高的检测方法。但是现有技术中适用于化学发光法测定用于胰岛素检测的试剂盒成分比较复杂，稳定性不够好，且其检测的灵敏度和特异性有待进一步提高。鉴于此，如何提供一种特异性强、稳定性好、能提高了检测的灵敏度和特异性的胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法是本领域技术人员需要解决的技术难题。
技术实现思路
针对现有技术中试剂盒成分比较复杂，稳定性不够好，且其检测的灵敏度和特异性有待进一步提高的不足之处，本专利技术提供了一种特异性强、稳定性好、能提高了检测的灵敏度和特异性的胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法。本专利技术为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：设计一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS-生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS-AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液。优选的，所述的M试剂、R试剂以及胰岛素校准品中还均含有表面活性剂、稳定剂以及pH调节剂。优选的，所述试剂盒中的各试剂混合后的pH值范围为7-9。优选的，所述化学发光底物液的浓度范围为：5-20g/L，且其成分主要由浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液组成。优选的，所述化学发光底物液中浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液的组成比例为1：1-2：1-5。优选的，所述包被INS-生物素化抗体的磁微粒为抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒。优选的，所述的反应增强剂为PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000和PEG20000中的一种或多种。优选的，所述反应增强剂的浓度范围为：10-30g/L。本专利技术的一种胰岛素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：步骤一：制备M试剂：先配制Tris缓冲液，再将INS-生物素化抗体与链霉亲和素磁珠充分混匀加入适量Tris缓冲液于室温下充分混匀、定容后反应，得到M试剂；步骤二：制备R试剂先配制Tris缓冲液，再将INS-AP抗体加入Tris缓冲液中，充分混匀，定容后得到R试剂；步骤三：配制胰岛素校准品：配制Tris缓冲液，将两种不同浓度的胰岛素样品加入Tris缓冲液中，充分混匀，定容后得到胰岛素校准品；步骤四：分别向步骤一、步骤二、步骤三制备的M试剂、R试剂、胰岛素校准品中加入反应增强剂和化学发光底物液，再混合均匀。本专利技术的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：步骤一：在反应管中加入待检测样本，并依次加入M试剂、R试剂、反应增强剂混匀，20-40℃下温育30min，得到双抗原夹心复合物，并将双抗原夹心复合物固定在磁性微球上；步骤二：加清洗液，震荡，使磁性微球在磁场中沉降，除上清液，清除掉没有通过待测抗体形成双抗原夹心复合物的连接标记示踪物的抗原，重复步骤3-5次；步骤三：在反应管中加入化学发光底物液，充分混匀，通过发光测定仪检测发光值，计算得到抗胰岛素抗体的含量。本专利技术提出的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法与检测方法，有益效果在于：(1)本专利技术胰岛素检测试剂盒用于体外定量测定人体血清中胰岛素的含量，且本专利技术的试剂盒中磁微粒包被的是人胰岛素单克隆抗体，较现有化学发光免疫法相比，具有特异性强、稳定性好的有益效果，大大提高了检测的灵敏度和特异性；(2)本专利技术胰岛素检测试剂盒在主要原材料配比及表面活性剂的选择上进行了很多尝试，最终得到适合于此体系的磁微粒酶标抗体的组合，从而在测定快速灵敏、特异性高的前提下，整个体系稳定性好盒操作简便，非常适合于临床全自动化学发光测定仪配套使用；(3)本专利技术胰岛素检测试剂盒采用化学发光免疫夹心法测定血清中胰岛素水平；首先，将样本添加到含有包被着抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒、缓冲溶液和INS-AP标记抗体的反应管中。INS-AP标记抗体和人胰岛素分子上不同的抗原位点反应。人胰岛素与固定在顺磁性微粒上的单克隆抗人胰岛素结合，从而形成夹心复合物；在反应管内温育完成后，结合在固相上的物质置于磁场内被吸附，而未结合的物质被冲洗除去，然后将化学发光底物添加到反应管内，然后由全自动发光测定仪对反应中所产生的光进行测量；所产生光的量与样本中的人INS的浓度成正比，具有特异性强、稳定性好的优点，提高了检测的灵敏度和特异性；可广泛应用于体外定量测定人体血清中胰岛素的含量；(4)本专利技术胰岛素检测试剂盒采用化学发光免疫技术，其具有灵敏度高、稳定性好、特异性强、动力学范围宽、适于自动化操作等优点；(5)本专利技术的制备方法简单、容易在工业化生产中实现，有利于提高制备效率；同时，本专利技术的检测方法检测过程简单，大大简化了现有的检测步骤和程序。附图说明下面结合附图中的实施例对本专利技术作进一步的详细说明，但并不构成对本专利技术的任何限制。图1为本专利技术实施例二所示产品实验验证时利用零浓度校准品作为样本进行检测的最低检出限结果图；图2为专利技术实施例二所示产品实验验证时利用国家标准浓度的准确样品进行第一次检测结果示意图；图3为专利技术实施例二所示产品实验验证时利用国家标准浓度的准确样品进行第二次检测结果示意图；图4为专利技术实施例二所示产品实验验证时利用国家标准浓度的准确样品进行第一次检测结果示意图；图5为专利技术实施例二所示产品第一次实验验证时的线性范围内相关性测试结果图；图6为专利技术实施例二所示产品第二次实验验证时的线性范围内相关性测试结果图；图7为专利技术实施例二所示产品第三次实验验证本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS‑生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS‑AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：M试剂、R试剂、胰岛素校准品、反应增强剂和化学发光底物液，所述的M试剂包括浓度为2μg/mL包被INS-生物素化抗体的磁微粒、浓度为0.2mol/L的Tris缓冲液；所述的R试剂包括浓度为1μg/mL的INS-AP标记抗体、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液；所述的胰岛素校准品包括两种不同浓度的胰岛素样品及0.1mol/L浓度的Tris缓冲液。2.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述的M试剂、R试剂以及胰岛素校准品中还均含有表面活性剂、稳定剂以及pH调节剂。3.根据权利要求1或2所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的各试剂混合后的pH值范围为7-9。4.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液的浓度范围为：5-20g/L，且其成分主要由浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液组成。5.根据权利要求4所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液中浓缩清洗液、激发清洗液和预激发清洗液的组成比例为1：1-2：1-5。6.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述包被INS-生物素化抗体的磁微粒为抗人胰岛素单克隆抗体的顺磁性微粒。7.根据权利要求1所述的一种胰岛素纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述的反应增强剂为PEG4000、PEG6000...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保全，马国良，亓娟，谢燕霞，方洪帅，
申请(专利权)人：宏葵生物中国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37