本发明专利技术公开了一株恩拉霉素A组分单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用。本发明专利技术细胞株，分类命名为抗恩拉霉素A组分杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15785。本发明专利技术提供了所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，并制备了用于动物性食品中恩拉霉素残留检测的试剂盒，本发明专利技术中的恩拉霉素A组分单克隆抗体杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备方法为首次实现恩拉霉素A组分单克隆抗体产品的奠定了基础，完全抗原和包被抗原合成方法简便，获得的单克隆抗体具有较好的灵敏度（IC50值为108.5ng/mL），填补了国内产品的空白，同时也为免疫检测试剂盒的研发推广奠定了基础。
A Hybridoma Cell Line with Monoclonal Antibody Against Enramycin A Component and Its Application
The invention discloses a monoclonal antibody hybridoma cell of enramycin A component and its application. The cell strain of the invention, classified as hybridoma cell strain of component A of anti-enramycin, has been preserved in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Committee, and the storage number is CGMCC No. 15785. The invention provides the monoclonal antibody secreted by the hybridoma cells, and prepares a kit for the detection of enramycin residues in animal food. The preparation method of the hybridoma cell line and monoclonal antibody of enramycin A component in the invention lays a foundation for the first realization of the monoclonal antibody product of enramycin A component, and the complete antigen and coated antigen are combined. The method is simple, and the obtained monoclonal antibody has good sensitivity (IC50 value is 108.5ng/mL), which fills in the blank of domestic products and lays a foundation for the development and popularization of immunoassay kits.
【技术实现步骤摘要】
一株抗恩拉霉素A组分单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及食品安全免疫学检测
特别涉及抗恩拉霉素单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株2H1F91，以及该抗体的免疫检测应用。
技术介绍
恩拉霉素（enramycin）是链霉菌Streptomycesfungicidious分泌的由17种氨基酸和13种脂肪酸所组成的一种多肽类化合物，主要成分为恩拉霉素A（C107H138C12N26O31）和恩拉霉素B(C108H140C12N26O31)，其中A组分活性要大于B组分，且残留中主要成分为A组分。恩拉霉素对梭状芽孢杆菌、链球菌、葡萄球菌和肺炎双球菌等革兰氏阳性菌有强大的抗菌活性，能够调节动物胃肠道菌群，因此作为一种的促生长类饲料添加剂用于畜禽动物使用。1974年，恩拉霉素作为药物在日本正式注册，由于其优良的促生长作用，被用作抗生素生长促进剂（AGP）添加到饲料中使用。2006年，日本在食品中引入肯定列表制度，禁止含量超过一定水平（一律标准）的食品销售，恩拉霉素残留量限定在0.01mg/kg。2010年，韩国农林渔业食品部也在《饲料管理法案》中禁止将恩拉霉素作为饲料添加剂。2016年，中国农业部第2271号规定了恩拉霉素预混剂在饲料中的添加量，每1000kg饲料，猪2.5-20g；鸡1-5g，蛋鸡产蛋期禁用，且禁止与四环素类、吉他霉素、杆菌肽、维吉尼亚霉素配伍使用。近年来，由于抗生素耐药性迅速增加，特别是多重耐药（MDR）微生物的出现，使人们对这些抗生素进行了重新评估。尽管恩拉霉素在畜禽生产中使用具有优势，但一旦它们在饲料中被滥用或者停药期缩短，都有可能导致动物机体中的药物残留，进而在食物中残留。长期食用含有抗生素残留的食物，会使MDR病原体进入人体，从而减少抗生素对细菌感染疾病的疗效，从而导致更多的死亡。中国目前还未有关于恩拉霉素在动物性食品中残留的限定标准，且检测水平较发达国家落后，因此制备高灵敏度的抗恩拉霉素A组分单克隆抗体用于动物性食品中恩拉霉素的快速检测势在必行。目前检测恩拉霉素的方法主要为微生物法、仪器分析方法和免疫检测法，目前国内用于恩拉霉素含量测定还是按照农业部1999年发布的《进口兽药质量标准》和中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局在2008年发布的《饲料中恩拉霉素的测定微生物学法》中的液相检测法和微生物检测法。微生物检测法具有不需要特殊设备、操作简单、适用于大批量检测等优点，缺点是重复性差，结果判定易受主观条件干扰。仪器分析方法如液相色谱法（HPLC）、液质联用技术（LC-MS）等可以定量检测样品，但是设备昂贵，操作繁琐，且需要经过培训的专业人员，不适用于现场大量样品的快速筛查。免疫分析方法是基于抗原抗体的免疫分析方法，如ELISA方法，胶体金检测方法等，由于其检测快、灵敏度高、通量高，已广泛用于食品中各类抗生素残留的快速检测。因此，迫切需要开发出基于高灵敏度抗恩拉霉素A组分单克隆抗体的免疫学快速检测方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一株稳定分泌能特异性识别恩拉霉素的高亲和力单克隆抗体杂交瘤细胞株，及其分泌的单克隆抗体在制备用于检测恩拉霉素免疫检测工具中的应用。本专利技术通过以下技术方案加以实现：本专利技术的第一方面，提供分泌恩拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.15785，是由纯度为97%以上得恩拉霉素A组分偶联载体蛋白，免疫BALB/c小鼠后，尾部采血，取血清效价大于1：12800的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG1450进行细胞融合；用含20%胎牛血清的HATRPMI-1640培养基筛选融合细胞。经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗恩拉霉素A组分单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术的第二方面，提供一种恩拉霉素单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNo.15785的杂交瘤细胞株产生。本专利技术的第三方面，提供第二方面所述单克隆抗体在制备用于免疫检测工具中的应用。具体实施例中，所述检测工具为试纸、试剂盒或生物芯片。具体实施例中，所述应用为在检测恩拉霉素含量中的应用；即所述单克隆抗体应用于检测样品中是否含有恩拉霉素残留。具体实施例中，所述样品选自动物性食品。具体实施例中，所述动物性食品选自猪肉、鸡肉、牛肉中的至少一种，视本领域需求而选择。本专利技术的第四方面提供了用于检测恩拉霉素含量的试剂盒，其中包括专利技术第二方面所述单克隆抗体。具体实施例中，所述试剂盒，包括但不限于酶联免疫试剂盒、化学发光检测试剂盒及免疫荧光检测试剂盒。具体实施例中，所述试剂盒为定量检测恩拉霉素残留的间接竞争酶联免疫（ic-ELISA）试剂盒，其中，本专利技术的第二方面所述单克隆抗体作为检测抗体。本专利技术还提供了上述试剂盒在检测动物性食品中恩拉霉素含量的应用。具体实施例中，所述动物性食品为猪肉。本专利技术以高纯度恩拉霉素A组分作为半抗原偶联载体蛋白免疫小鼠，获得的单克隆抗体亲和力高，特异性强，制备出的检测方法特异性好，灵敏度高，线性范围广。目前，市场上没有针对恩拉霉素的抗体出售，仅有以恩拉霉素A、B组分混合物作为半抗原，免疫动物，制备多克隆抗体的类似免疫检测方法。本专利技术的间接竞争ELISA方法批内变异系数低于10%，线性范围为1.9-150ng/mL在猪肉中的检测限为39.4μg/kg。因此，本专利技术的单克隆抗体灵敏度更高，且制备的方法的检测限低，有更广泛的应用空间。保藏信息：一株抗恩拉霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为2H1F91，保藏编号为CGMCCNo.15785，保藏日期为2018年05月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。附图说明图1为纯度97%以上的恩拉霉素A组分液相色谱图；图2为纯度97%以上的恩拉霉素A组分的液质图；图3为抗恩拉霉素A组分单克隆抗体的亲和力测定结果图；图4为猪肉样品提取液不同稀释倍数下添加一定浓度恩拉霉素标准品下的标准曲线图；图5为使用本专利技术制备的间接竞争ELISA试剂盒检测恩拉霉素标准品的标准曲线图。具体实施方式通过下面的实施例对本专利技术作进一步说明，结合附图可以进一步理解本专利技术的优点和特点，但不限制本专利技术的范围。骨髓瘤细胞SP2/0来源于中国典型培养物保藏中心（武汉大学），6-8周龄的BALB/C雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。胎牛血清购自维森特生物技术有限公司，细胞融合用PEG1450，50XHAT贮液，50XHT贮液，BSA，OVA均购自sigma，RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司。实施例1动物免疫及杂交瘤细胞株2H1F91的获得：一、动物免疫及杂交瘤细胞株2H1F91的获得1.恩拉霉素完全抗原Er-A-BSA的制备:室温下，将72mg的恩拉霉素-A（0.03mmol），300mg（0.09mmol）的N，N'-羰基二咪唑和220mg的4-二甲基氨基吡啶（0.09mmol）在2.5mL的二甲基甲酰胺中反应过夜。在连续搅拌期间将溶液滴加到200mgBSA的PBS溶液（0.1molL-1，pH8.0）中。将混合物在4℃下搅拌24小时，然后以5000rpm离心10分钟。使用P本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株抗恩拉霉素A组分单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为2H1F91，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年05月22日，保藏号为CGMCC No.15785。
【技术特征摘要】
1.一株抗恩拉霉素A组分单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为2H1F91，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年05月22日，保藏号为CGMCCNo.15785。2.权利要求1所述菌株单克隆细胞株2H1F91分泌产生的抗恩拉霉素A组分单克隆抗体，其特征在于：由保藏编号为CGMCCNo.15785的杂交瘤细胞株所分泌产生。3.权利要求1所述恩拉霉素A组分单克隆抗体杂交瘤2H1F91的制备方法，其特征在于包括如下步骤：高纯度恩拉霉素A组分与载体蛋白通过羰基二咪唑法偶联，分别作为免疫原与包被原，透析后免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间进行两次以上免疫，取血清效价大于1：12800的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG1450进行细胞融合；用含20%胎牛血清的HATRPMI-1640培养基筛选融合细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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