产生牛妊娠相关糖蛋白特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒及检测制造技术

本发明专利技术涉及产生牛妊娠相关糖蛋白特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒及检测，其为两株产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该杂交瘤细胞株产生的两种特异性单克隆抗体H4和G7，检测牛PAG的试剂盒及其检测方法，该细胞株保藏编号分别为CCTCC NO：C2018170、CCTCC NO：C2018171。该试剂盒包含上述的两种单克隆抗体，并且，以H4作为捕获抗体，以G7作为检测抗体进行检测。在检测奶牛体内PAG浓度时，与奶牛体内的天然PAG具有较好的识别能力和结合能力，并通过建立标准的双抗体夹心ELISA体系，能够准确检测标本中的牛PAG，并以此成功建立了检测牛PAG的双抗体夹心ELISA方法，对多种形式的PAG免疫检测试剂的进一步研究具有很大的意义。

Hybridoma cell lines, monoclonal antibodies, kits and detection of specific monoclonal antibodies to bovine pregnancy-related glycoproteins

The present invention relates to mouse hybridoma cell lines, monoclonal antibodies, kits and detection for producing specific monoclonal antibodies to bovine pregnancy-related glycoproteins. They are two hybridoma cell lines producing specific monoclonal antibodies to bovine PAG. Two specific monoclonal antibodies, H4 and G7, produced by the hybridoma cell lines, kits for detecting bovine PAG and their detection methods, and preservation edition of the cell lines. No. CCTCC NO: C2018170 and CCTCC NO: C2018171 respectively. The kit contains the two monoclonal antibodies mentioned above, and detects them with H4 as capture antibody and G7 as detection antibody. When detecting the concentration of PAG in dairy cows, it has good recognition and binding ability with natural PAG in dairy cows. By establishing a standard double antibody sandwich ELISA system, it can accurately detect bovine PAG in samples. Based on this, a double antibody sandwich ELISA method for detecting bovine PAG has been successfully established, which is of great significance for further study of various types of PAG immunoassay reagents.

【技术实现步骤摘要】
产生牛妊娠相关糖蛋白特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒及检测
本专利技术涉及生物医药工程
，并且更具体地，涉及到产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，特异性单克隆抗体，检测牛PAG的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
早期妊娠判断是保证和提高奶牛繁殖率和产奶量的关键环节之一。在奶牛配种或人工受精后，都需要及时进行早期妊娠判断。空怀牛发现越早，就能越早进行第二次发情管理和配种，缩短配种间隔，从而提高妊娠率，避免或减少母牛早期妊娠缺失造成的各种损失。因此牛的早期妊娠诊断一直是畜牧业发展中值得高度关注的重要问题。传统的牛早孕判断主要包括三种方法：直肠触诊法、超声波诊断法、血液或牛奶中孕酮检测法。直肠触诊法成本低，能马上得到结果，如果操作者的经验和水平高，该法的准确率可达95％以上，通常在配种后35～65天由兽医来进行首次检查，并在较多时候被作为诊断妊娠的标准。但是该方法对操作人员或者牧场兽医有较高技术要求，一般饲养人员难以掌握，而且该操作对早期胚胎具有一定的侵害性，有结果表明该操作与胚胎死亡之间存在明确的相关性。超声波诊断法与直肠触诊法相比危害较小，操作简便，准确率高。有研究资料表明在配种后21～25天检测，妊娠的敏感性和特异性分别是44.8％和82.3％；如果在配种后26～33天检测，其敏感性和特异性可分别提高至97.7％和87.7％。但由于B超仪器价格较高，体积较大使其难以在生产实践中广泛应用。基于放射免疫原理检测奶牛血液或牛奶中孕酮也可用于早期妊娠的判断，最佳的孕酮检测时间是配种后24天，因为这时候进行检测能在一定程度上消除长发情间隔造成的假阳性，现场检测牛奶中的孕酮敏感性约为93.1％，但是其特异性只有39.3％，意味着这种情况下可能会将大量非孕牛误判为妊娠牛，造成损失。同时该方法涉及到的放射性污染等问题也为其大量推广应用带来了较大程度的限制。目前市场上有售的胶体金试纸条检测奶牛乳汁中孕酮来判断奶牛妊娠，与实际情况具有较好的符合率，但其判断标准很难确定，而且影响因素较多，因此通过检测孕酮判断妊娠的方法在国内仍未得到广泛的推广应用。研究表明，奶牛妊娠后，胎盘滋养层双核细胞在与母体子宫上皮细胞融合时，会分泌释放出多种特征性的蛋白，部分蛋白可以作为牛早期妊娠的生物标志物，其中研究最为深入并被广泛认可的是妊娠相关糖蛋白（pregnancyassociatedglycoproteins，PAG）。PAG蛋白和胃蛋白酶、组织蛋白酶D等属于天冬氨酸脱氢酶家族，目前已知的PAG蛋白有22种。多项研究表明：奶牛体内PAG浓度从妊娠开始后缓慢上升，配种1个月后妊娠奶牛与非妊娠奶牛PAG浓度出现显著差别，奶牛妊娠的2～3月PAG浓度出现上升和下降的波动，不过其平均浓度仍在不断上升；奶牛妊娠的4～7月PAG浓度出现较快上升趋势；在分娩前PAG浓度达到最大值。这些结果为通过测定PAG浓度水平来判断奶牛妊娠提供了理论依据。事实上，有文献表明，基于PAG特异性抗体建立的放射免疫分析法，对配种后35天的奶牛妊娠确诊率为93.03%，空怀率确认为97.90%，表明PAG完全可以作为牛妊娠诊断检测的标志物。随着技术的发展，以PAG为检测目标的检测方法越来越多，如美国IDEXXLaboratories等公司生产的牛怀孕检测试剂盒，基于固相酶联免疫吸附试验，可用于检测牛血清或EDTA抗凝牛血浆中PAG的检测。任何免疫学检测方法的核心原料都是特异性抗原或抗体。目前试剂盒中所用的抗体多是以体外重组表达的PAG（如昆虫表达系统表达的PAG）作为免疫原免疫动物制备的。但是已有研究表面，奶牛体内的PAG存在高度异质性，而且存在较大程度的翻译后修饰，包括糖基化、磷酸化和乙酰化等等。体外重组表达的单一PAG很难代表奶牛体内PAG的免疫原性，其特异性抗体与奶牛体内天然PAG结合能力存在不确定性。基于此，确保抗体与天然PAG的识别和结合能力，制备更多的PAG特异性抗体供业界应用，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，目的在于提供一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，特异性单克隆抗体，检测牛PAG的试剂盒及其检测方法，其能确保抗体与天然PAG的结合和识别能力。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一方面，本专利技术的实施例公开了一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018170。（H4）另一方面，本专利技术实施例公开了一种单克隆抗体，其特征在于，由上述的杂交瘤细胞株产生。（H4）第三方面，本专利技术实施例还公开了一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018171。（G7）第四方面，本专利技术实施例公开了一种单克隆抗体，其特征在于，由上述的杂交瘤细胞株产生。（G7）第五方面，本专利技术实施例还公开了上述两种杂交瘤细胞株的制备方法，均由纯化的天然牛PAG蛋白免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合后培养产生。第六方面，本专利技术实施例还公开了一种试剂盒，其包含上述两种单克隆抗体。进一步地，该试剂盒用于检测牛PAG。第七方面，本专利技术实施例还公开了采用上述试剂盒检测奶牛体内PAG浓度的方法，采用保藏编号为CCTCCNO：C2018170的单克隆抗体作为捕获抗体，采用保藏编号为CCTCCNO：C2018171的单克隆抗体作为检测抗体。进一步地，所述检测抗体采用HRP标记。进一步地，所述HRP标记包括：将所述检测抗体与HRP按质量比1:1混合后，加入碳酸钠缓冲液，调节至预定的pH值后进行反应。。本专利技术的有益效果是：采用本专利技术公开的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，在检测奶牛体内PAG浓度时，与奶牛体内的天然PAG具有较好的识别能力和结合能力，并通过建立标准的双抗体夹心ELISA体系，能够准确检测标本中的牛PAG，并以此成功建立了检测牛PAG的双抗体夹心ELISA方法，对多种形式的PAG免疫检测试剂的进一步研究具有很大的意义。附图说明图1为基于新制备的牛PAG单克隆抗体建立的ELISA检测方法检测奶牛血清稀释样本中PAG的剂量反应曲线。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例以纯化自产后牛胎盘子叶的天然牛PAG蛋白免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术进行细胞融合，利用间接ELISA法和细胞克隆化操作筛选出能稳定分泌牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，小鼠腹水诱生法制备的腹水经HiTrapIgGPurificationHP亲和层析柱纯化，对所得的单克隆抗体进行效价测定。经筛选得到2株稳定分泌牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株H4（保藏编号为CCTCCNO：C2018170）和G7（保藏编号为CCTCCNO：C2018171），ELISA和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。另外，本专利技术实施例还建立了针对牛PAG的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018170 。

【技术特征摘要】
1.一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018170。2.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。3.一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018171。4.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求3所述的杂交瘤细胞株产生。5.权利要求1或3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，由纯化的天然牛PAG蛋白免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡建辉，徐淞，李艳，胡川闽，孙美艳，王会岩，刘静，
申请(专利权)人：吉林医药学院，重庆探生科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22