【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物与新医药，具体涉及一种用于鉴定蛇的lamp引物组、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、动物源中药材是指用动物的整体、某一部分、生理或病理产物等经加工炮制后供药用的一类中药，在中药材市场有着巨大潜力和重要地位，在临床上的作用和功效也无法替代。2020 年版《中国药典》共收录了49类动物源中药和497 种相关处方制剂。蛇是我国分布广泛、种类众多的一类动物，将蛇作为中药用于临床治疗与日常保健中已有数千年。我国以蛇入药最早的文字记载大概见于《山海经》，其上书“巴蛇食象，三岁而出其骨；君子服之无心腹之疾”。《神农本草经》下品卷虫鱼部中已收入蛇蜕；南北朝陶弘景《本草经集注》中，收载了蝮蛇胆及蚺蛇胆、膏入药；刘宋时代雷敩所著《雷公炮制论》中记载以蕲蛇、乌梢蛇入药；唐代陈藏器《本草拾遗》中收载蛇婆（海蛇的一种，即半环扁尾蛇）入药；明朝李时珍《本草纲目》记载了17种蛇类药材，其中有蕲蛇、乌梢蛇等详细的论述与深入的研究。我国在蛇的药用历史中也有众多的规格等级。因此,药用蛇使用的复杂性使历代医者对药用蛇的品种、规格、炮制、使用方法、毒性及临床适应证的记载既有延续又有变迁，因此不管在药材鉴别还是临床使用中都易发生混淆、误用等情况。由于动物源中药材其他来源外形均已改变，造成鉴定困难，对于鉴定人员的专业性和经验要求更高，鉴定结果并不完全准确可靠，所以，急待建立快速准确的动物源药材鉴定方法。
2、环介导等温扩增(lamp)是一种新颖的核酸扩增技术，其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，并在具有链置换特性的bst dna聚
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于鉴定金钱白花蛇和蕲蛇的特异性碱基序列。
2、本专利技术的目的在于提供一种用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的lamp引物组。
3、本专利技术的再一目的在于提供一种用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的lamp鉴定方法。
4、进一步地，本专利技术提供了一种lamp引物组及检测方法在鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇中的应用，包括但不限于lamp检测试剂盒。
5、为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
6、一种用于鉴定金钱白花蛇和蕲蛇的特异性碱基序列，所述用于鉴定金钱白花蛇的特异性碱基序列如seq id no.1所示，用于鉴定蕲蛇的特异性碱基序列如seq id no.2所示。
7、一种用于鉴定金钱白花蛇和蕲蛇特异性碱基序列的lamp引物组，其特征在于：seqid no.4-seq id no.9为鉴定金钱白花蛇的lamp引物组，seq id no.10-seq id no.14为鉴定蕲蛇的lamp引物组。
8、一种用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的lamp引物组，所引物组序列如表1所示，seq id no.4-seq id no.9为鉴定金钱白花蛇的lamp引物组，seq id no.10-seq idno.14为鉴定蕲蛇的lamp引物组，seq id no.15-seq id no.20为鉴定乌梢蛇的lamp引物组，其中鉴定乌梢蛇的lamp引物组对应的特异序列为seq id no.3，fip和bip为内引物，f3和b3为外引物，lf和lb为环引物。
9、一种用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的lamp鉴定方法，具体方法如下：
10、（1）根据金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇cytochrome b基因组序列(genbank:aj565001.1；genbank: af171919.1；genbank: dq272474.1)设计lamp引物组；
11、（2）提取金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的基因组dna，作为模板；
12、（3）用所述引物进行lamp扩增，对金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇进行鉴定。
13、优选的，所述lamp扩增体系为25 μl：2×reaction mix 12.5 μl，bst dna 聚合酶1 μl，外引物f3和b3各5 pmol，内引物fip和bip各40 pmol，环引物lf和lb 各加20 pmol（若只用1条环引物，则单独1条加20 pmol），基因组dna 1 μl，染料ft 1μl超纯水补足25 μl。
14、优选的，所述lamp扩增的温度为62-66℃，更优选的为62℃，扩增时间为40min
15、一种lamp引物组及检测方法在鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇中的应用，包括但不限于lamp检测试剂盒，所述试剂盒包含所述lamp引物组或包含所述lamp引物组的微流控芯片。
16、本专利技术具有以下有益效果：
17、动物源中药材由于来源外形均已改变，造成鉴定困难，对于鉴定人员的专业性和经验要求更高，传统鉴定方法并不完全准确可靠。本专利技术针对金钱白花蛇、蕲蛇、乌梢蛇三种动物源性中药的cytochrome b基因序列设计了大量lamp引物，并进行一一筛选，筛选鉴定出可用于金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的特征序列，建立了一种对于金钱白花蛇、蕲蛇、乌梢蛇检测的敏感高效准确方法，此方法操作简便，结果准确，耗时较短，观测方法简单直接，是适应金钱白花蛇、蕲蛇、乌梢蛇现场鉴定的快速方法。相较传统的pcr检测方法，具有操作简单，省时省力，并且反应精确度高的特性。旨在为基层实验室及养殖基地提供一种高效、快速、实用及经济的蛇源中药材的快速鉴别方法，容易普及且适用于现场操作。
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1.一种用于鉴定金钱白花蛇和蕲蛇的特异性碱基序列，其特征在于：所述用于鉴定金钱白花蛇的特异性碱基序列如SEQ ID NO.1所示，用于鉴定蕲蛇的特异性碱基序列如SEQID NO.2所示。
2.如权利要求1所述一种用于鉴定金钱白花蛇和蕲蛇特异性碱基序列的LAMP引物组，其特征在于：SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.9为鉴定金钱白花蛇的LAMP引物组，SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.14为鉴定蕲蛇的LAMP引物组。
3.一种用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的特异性碱基序列，其特征在于：所述用于鉴定金钱白花蛇的特异性碱基序列如SEQ ID NO.1所示，用于鉴定蕲蛇的特异性碱基序列如SEQ ID NO.2所示；用于鉴定乌梢蛇的特异性碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求3所述一种用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇特异性碱基序列的LAMP引物组，其特征在于：SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.9为鉴定金钱白花蛇的LAMP引物组，SEQ IDNO.10-SEQ ID NO.14为鉴定蕲蛇的LAMP引物组，SE
5.采用如权利要求4所述LAMP引物组的LAMP鉴定方法，其特征在于，具体方法如下：
6.如权利要求5所述的LAMP鉴定方法，其特征在于：所述LAMP扩增体系为25 μL：2×Reaction Mix 12.5 μL，Bst DNA 聚合酶 1 μL，外引物F3和B3各5 pmol，内引物FIP和BIP各40 pmol，环引物LF和LB 各加20 pmol，基因组DNA 1 μL，染料Ft 1μL超纯水补足25 μL。
7.如权利要求5所述的LAMP鉴定方法，其特征在于：所述LAMP扩增的温度为62-66℃，扩增时间为40min左右。
8.如权利要求1所述用于鉴定金钱白花蛇和蕲蛇的特异性碱基序列在鉴定金钱白花蛇、蕲蛇中的应用，包括但不限于用于制备LAMP检测试剂盒。
9.如权利要求2所述的LAMP引物组在鉴定金钱白花蛇和蕲蛇中的应用，其特征在于：包括但不限于用于制备LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括所述LAMP引物组或包含所述LAMP引物组微流控芯片。
10.如权利要求3所述用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的特异性碱基序列在鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇中的应用，包括但不限于用于制备LAMP检测试剂盒。
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定金钱白花蛇和蕲蛇的特异性碱基序列，其特征在于：所述用于鉴定金钱白花蛇的特异性碱基序列如seq id no.1所示，用于鉴定蕲蛇的特异性碱基序列如seqid no.2所示。
2.如权利要求1所述一种用于鉴定金钱白花蛇和蕲蛇特异性碱基序列的lamp引物组，其特征在于：seq id no.4-seq id no.9为鉴定金钱白花蛇的lamp引物组，seq id no.10-seq id no.14为鉴定蕲蛇的lamp引物组。
3.一种用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇的特异性碱基序列，其特征在于：所述用于鉴定金钱白花蛇的特异性碱基序列如seq id no.1所示，用于鉴定蕲蛇的特异性碱基序列如seq id no.2所示；用于鉴定乌梢蛇的特异性碱基序列如seq id no.3所示。
4.如权利要求3所述一种用于鉴定金钱白花蛇、蕲蛇和乌梢蛇特异性碱基序列的lamp引物组，其特征在于：seq id no.4-seq id no.9为鉴定金钱白花蛇的lamp引物组，seq idno.10-seq id no.14为鉴定蕲蛇的lamp引物组，seq id no.15-seq id no.20为鉴定乌梢蛇的lamp引物组。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：李亚巍，朱文赫，孙艳美，谭紫凝，张红，何云龙，吴昊，王悦欣，刘晴晴，
申请(专利权)人：吉林医药学院，
类型：发明
国别省市：
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