本发明专利技术公开了一种毒莴苣的PCR检测引物、试剂盒和PCR检测方法，特点是包括正向引物ITS1‑F和反向引物ITS1‑R，正向引物ITS1‑F的序列如SEQ ID NO1所示，反向引物ITS1‑R的序列如SEQ ID NO1所示，其试剂盒包括5×FastPfu Buffer 4μl，2.5mMdNTPs2μl，5μM正向引物ITS1‑F 0.8μl，5μM反向引物ITS1‑R 0.8μl，FastPfu聚合酶0.4μl，DNA模板10ng，补ddH2O至20μl，其检测方法包括样品DNA提取，PCR扩增以及琼脂糖电泳结果分析，优点是灵敏度高、特异性强。
A PCR Detection Primer, Kit and PCR Method for Toxic Lettuce
The invention discloses a PCR detection primer, kit and a PCR detection method for lettuce poisoning, characterized by including forward primer ITS1 F and reverse primer ITS1 R, forward primer ITS1 F sequence as shown in SEQ ID NO1, reverse primer ITS1 F sequence as shown in SEQ ID NO1, reverse primer ITS1 R sequence as shown in SEQ ID NO1, its kit includes 5 *FastPfu Buffer 4 muffer 4 mul, 2.5mmdMdNTPs2mul, 5 mutPfu MdNT2MNTPs2mul, 5 Mumu forward primer ITS1 ITS1 5 The detection methods include sample DNA extraction, PCR amplification and agarose electrophoresis analysis. The advantages are high sensitivity and specificity.
【技术实现步骤摘要】
一种毒莴苣的PCR检测引物、试剂盒以及PCR检测方法
本专利技术涉及一种毒莴苣检测方法，尤其是涉及一种毒莴苣的毒莴苣的PCR检测引物、试剂盒以及PCR检测方法。
技术介绍
毒莴苣(LactucaserriolaL.)又名刺莴苣，属菊科莴苣属的一类杂草，是2007年新列入我国检疫性有害生物名录的杂草之一。毒莴苣原产于欧洲，1860年传入北美，目前主要分布在法国、德国、意大利、俄罗斯等地，在我国的新疆部分地区、昆明、沈阳及杭州等地有局部分布，近年来在宁波港区也有零星发现。由于毒莴苣全株有毒，混杂于蔬菜中极易引起人畜中毒，而且毒莴苣是一种高光效植物植株高大，易在入侵地形成群落优势种，毒莴苣主要以种子进行繁殖，每株最大结实量达52700粒，种子具冠毛，可以借助水力、风力进行远距离传播。因此做好对毒莴苣的检验检疫工作，是阻止或延缓其在我国传播、危害的有效途径之一，也是第一道防线。毒莴苣是一种危险性较大的有毒杂草，不但能严重危害粮食作物的生产安全，而且易引起人畜中毒，近年来国内外学者对其形态特征、危害性、生态、生物学特性等方面进行了一系列的研究。如国家质量监督检验检疫总局在2009年发布了毒莴苣检疫鉴定标准，为该类杂草的鉴定提供了依据；郭水良（2006）等对检疫性杂草毒莴苣的光合特征及其入侵地群落学生态调查，研究结果表明；该物种是一种高光效植物，比入侵性杂草一年蓬、野塘蒿稍低，但比藜、北美车前、山莴苣等高，而且毒莴苣的光合作用具有明显的午休现象；孙立彦等（2000）对山莴苣进行了核型分析研究，研究结果表明，山莴苣染色体数目2n=18，核型为“2B”型，在进化过程中处于比较进化的地位，为山莴苣良种选育和植物分类提供了细胞学依据。毕志明等（1996）从多裂山莴苣的根中分离鉴定了7个化合物，其中化合物11β-13-二氢莴苣内酯乙酸酯和胡萝卜甙具显著的细胞毒活性；梁照文等（2015）对毒莴苣及其近似种进行了EST-SSR标记的开发，搜索到SSR位点1465个，发现重复基元598种，构建了11个毒莴苣及其近似种的系统发育树。目前，国内外对于莴苣属杂草的研究主要集中一些国内分布较广的山莴苣、北山莴苣等杂草的遗传分类地位、危害性及生物学特性等方面，DNA分子标记技术是利用一个或少数几个DNA片段对地球上现有物种进行识别和鉴定的一项新技术，为近年来进展最迅速的学科前沿之一，已被广泛应用于多个物种的种类鉴定工作中，而毒莴苣及其近似种在这方面的研究基本还处于空白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强的毒莴苣的PCR检测引物、试剂盒以及PCR检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种毒莴苣的PCR检测引物，包括正向引物ITS1-F和反向引物ITS1-R，所述的正向引物ITS1-F的序列为SEQIDNO1所示：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，所述的反向引物ITS1-R的序列为SEQIDNO2所示：TATCCGTTGCCGAGAGTC。2、一种毒莴苣的PCR检测试剂盒，包括5×FastPfuBuffer4μl，2.5mMdNTPs2μl，5μM正向引物ITS1-F0.8μl，5μM反向引物ITS1-R0.8μl，FastPfu聚合酶0.4μl，DNA模板10ng，补ddH2O至20μl，所述的正向引物ITS1-F的序列为：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，所述的反向引物ITS1-R的序列为TATCCGTTGCCGAGAGTC。3、一种毒莴苣的PCR检测方法，包括以下步骤：（1）DNA模板提取（2）建立扩增体系将5×FastPfuBuffer4μl，2.5mMdNTPs2μl，5μM正向引物ITS1-F0.8μl，5μM反向引物ITS1-R0.8μl，FastPfu聚合酶0.4μl，DNA模板10ng，补ddH2O至20μl，所述的正向引物ITS1-F的序列为：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，所述的反向引物ITS1-R的序列为TATCCGTTGCCGAGAGTC；（3）扩增反应将步骤（2）建立的扩增体系进行扩增反应，于95℃5minutes1个循环；95℃30seconds、55℃30seconds、72℃45seconds共27个循环；72℃10minutes；10℃保温；（4）结果分析PCR扩增结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分子量为300bp的蛋白条带即为毒莴苣产物。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种毒莴苣的PCR检测引物、试剂盒以及PCR检测方法，首次设计了毒莴苣的特异性引物，公开了其rDNA-ITS区PCR的扩增检测方法。该引物组具有特异性强，灵敏度高的特点，这与引物本身的质量（如长度、GC含量）、退火温度等因素直接有关。整个检测过程使用普通的常用PCR反应体系扩增试剂盒，不需要复杂仪器设备，只需普通PCR仪即可完成，尤其适合设备资源配置简单的口岸实验室开展现场快速筛查，具有较强的推广价值。附图说明图1为本专利技术PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。具体实施例一一种毒莴苣的PCR检测引物，包括正向引物ITS1-F和反向引物ITS1-R，其中正向引物ITS1-F的序列为SEQIDNO1所示：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，反向引物ITS1-R的序列为SEQIDNO2所示：TATCCGTTGCCGAGAGTC。具体实施例二一种毒莴苣的PCR检测试剂盒，包括5×FastPfuBuffer4μl，2.5mMdNTPs2μl，5μM正向引物ITS1-F0.8μl，5μM反向引物ITS1-R0.8μl，FastPfu聚合酶0.4μl，DNA模板10ng，补ddH2O至20μl，所述的正向引物ITS1-F的序列为：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，所述的反向引物ITS1-R的序列为TATCCGTTGCCGAGAGTC。具体实施例三一种毒莴苣的PCR检测方法，包括以下步骤：（1）DNA模板提取：采用高效植物基因组DNA提取试剂盒（Hi-DNAsecurePlantKit）提取毒莴苣样品DNA；（2）建立扩增体系将5×FastPfuBuffer4μl，2.5mMdNTPs2μl，5μM正向引物ITS1-F0.8μl，5μM反向引物ITS1-R0.8μl，FastPfu聚合酶0.4μl，DNA模板10ng，补ddH2O至20μl，所述的正向引物ITS1-F的序列为：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，所述的反向引物ITS1-R的序列为TATCCGTTGCCGAGAGTC；（3）扩增反应将步骤（2）建立的扩增体系进行扩增反应，于95℃5minutes1个循环；95℃30seconds、55℃30seconds、72℃45seconds共27个循环；72℃10minutes；10℃保温；（4）结果分析PCR扩增结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）回收分子量为300bp的蛋白条带送测序公司进行测序，测序结果为毒莴苣，其基因序列如下SEQIDNO3所示：CCCGTAGGGAGTCTTGTCGAcCCTGCAGGCAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种毒莴苣的PCR检测引物，其特征在于：包括正向引物ITS1‑F和反向引物ITS1‑R，所述的正向引物ITS1‑F的序列为SEQ ID NO1所示：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，所述的反向引物ITS1‑R的序列为SEQ ID NO2所示：TATCCGTTGCCGAGAGT。
【技术特征摘要】
1.一种毒莴苣的PCR检测引物，其特征在于：包括正向引物ITS1-F和反向引物ITS1-R，所述的正向引物ITS1-F的序列为SEQIDNO1所示：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，所述的反向引物ITS1-R的序列为SEQIDNO2所示：TATCCGTTGCCGAGAGT。2.一种毒莴苣的PCR检测试剂盒，其特征在于：包括5×FastPfuBuffer4μl，2.5mMdNTPs2μl，5μM正向引物ITS1-F0.8μl，5μM反向引物ITS1-R0.8μl，FastPfu聚合酶0.4μl，DNA模板10ng，补ddH2O至20μl，所述的正向引物ITS1-F的序列为：TAACAAGGTTTCCGTAGGTG，所述的反向引物ITS1-R的序列为TATCCGTTGCCGAGAGTC。3.一种毒莴苣的PCR检测方法，其特征在于包...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑炜，赵雷，徐颖，于莹，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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